Molekularbiologische Untersuchungen zur Gibberellin-Biosynthese des Ascomyceten Gibberella fujikuroi

Durch konventionelle Transformation wurden 24 Mutant en von Giberelly fujikuroi erzeugt, die nicht mehr in der Lage sind, Gibberelline zu bilden. Diese wurden zusammen mit den beiden bereits von Linnemannstöns (1996) mittels REMI produzierten gib-Stämmen charakterisiert. Bei 25 dieser Stämme fand die Vektorintegrationen an einer bestimmten Stelle im Genom statt, einem sogenannten „hot spot“ der Rekombination. Alle Stämme weisen eine große Deletion auf, die unter anderem das gesamte „Gencluster“ der Gibberellin-Biosynthese umfaßt, und somit die Ursache für den „gib-Phänotyp“ ist. Mittels PFGE konnte gezeigt werden, daß die Deletion ca. 300 bis 400 kb umfaßt, das Chromosom 4 betrifft und nicht direkt mit dem Ort der Vektorintegration gekoppelt ist. Auch das „Gencluster“ der Gibberellin-Biosynthese wurde auf Chromosom 4 nachgewiesen. Zudem wurde eine Chromosomenkarte erstellt, in der die Gene areA G.f., creA G.f., nmr G.f., hmg, fdp, ggsl, niaD und phs, die mit der Gibberellinproduktion in Zusammenhang stehen oder stehen könnten, den Chromosomen von G. fujikuroi zugewiesen werden konnten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein DNA-Bereich jenseits des orf3-Gens auf bisher unbekannte Gene des „Genclusters“ der Gibberellin-Biosynthese hin untersucht. Es wurde ein Abschnitt von 9,6 kb sequenziert und charakterisiert, wobei vier offene Leserahmen entdeckt wurden. Anhand von Sequenzvergleichen mit bekannten Genen und Proteinen konnten sie als Gene identifiziert werden, die für eine Aldebyddehydrogenase (ald-Gen), eine Alkoholdehydrogenase (arc-Gen), ein Protein mit Ankyrindomänen (ank-Gen) und einen Membrantransporter (smt-Gen) kodieren. Das aid-, alc- und smt-Gen wird während der Hauptproduktionsphase der Gibberelline exprimiert, wohingegen das Transkript des ank-Gens in geringerer Menge auch schon während der Wachstumsphase nachgewiesen wurde. Die Aldehyd- und die Alkoholdehydrogenase könnten im Rahmen der Biosynthese der Gibberelline, das Ank-Protein bei deren Regulation und der Membrantransporter bei der Ausschleusung der Gibberelline aus der Zelle eine Rolle spielen. Die Promotoranalysen der einzelnen Gene lieferten sowohl Indizien für als auch gegen deren Zugehörigkeit zum „Gencluster“ der Gibberellin-Biosynthese. Für das smt-Gens wurden „Gene Disruption“-Mutanten erzeugt, doch brachte ihre Analyse keine Bestätigung dafür, daß dieses Gen zum „Gencluster“ gehört. Eine weitere Charakterisierung dieser vier neu entdeckten Gene, beispielsweise durch erneute, abgeänderte Versuche sie zu inaktivieren, wäre von großer Bedeutung für die weitere Aufklärung der Biosynthese der Gibberelline in G. Fujikuroi