Untersuchung zur Aktivität des Transposons Restless in dem heterologen Wirt Neurospora crassa von Windhofer,  Frank

Untersuchung zur Aktivität des Transposons Restless in dem heterologen Wirt Neurospora crassa

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Aktivität des Transposons Restless in dem Hyphenpilz Neurospora crassa analysiert. Dabei wurden Untersuchungen zum Nachweis der Restless-Exzision und zum Einfluß wirtsspezifischer Faktoren auf die Aktivität dieses Transposons durchgeführt. Zusammengefaßt wurden folgende Ergebnisse erhalten: 1. Es wurden verschiedene Vektorkonstrukte für die Transformation von N. crassa hergestellt. Diese Vektoren enthielten unterschiedliche Restless-Kopien. Mit Hilfe PCR-vermittelter in vitro Mutagenese wurden Veränderungen innerhalb der Restless-Sequenz vorgenommen, um eine Optimierung der Restless-Aktivität in dem heterologen Wirt zu erzielen. 2. Das Transposon Restless wurde erfolgreich in den Hyphenpilz N. crassa transformiert. Integriert das Transposon in vielen Kopien in das Genom von N. crassa, so wird es in vegetativen Hyphen methyliert. Diese Methylierung beruht auf einem hohen TpA-Dinukleotid-Verhältnis in bestimmten Abschnitten der Restless-Sequenz. Wurde das Transposon jedoch mit einer einzelnen Kopie über homologe Rekombination in der Nähe des his-3 Lokus integriert, so wurde es nicht methyliert. Transformanten mit einer einzelnen integrierten Restless-Kopie waren die Grundlage für die weiteren Untersuchungen zur Aktivität des Restless-Transposons in N. crassa. 3. Das Restless-Transkript wird in N. crassa gespleißt. Der Mechanismus des alternativen Spleißens von Restless wurde durch Veränderung der Intron-Spleißsequenzen näher untersucht. Die ursprüngliche Restless Intron-Sequenz wird in N. crassa nicht optimal erkannt und somit nicht effizient gespleißt. Eine Veränderung der 5′-Spleiß-Sequenz zu einer Konsensus-Sequenz für Hyphenpilze optimierte die Spleiß-Effizienz des Restless-Transkriptes. Die Modifikation an der 5′-Intron-Sequenz hatte jedoch keinen Einfluß auf das alternative Spleißen des Restless-Elementes. Ein optimiertes alternatives Spleißen konnte durch Modifikation der 3′-Spleiß-Sequenz erzielt werden. Der Spleiß-Mechansimus konnte vermutlich nur dann zwischen den beiden Kodonen unterscheiden, wenn an einer der zwei 3′-Spleiß-Sequenzen eine Modifikation vorlag. 4. Das Transposon Restless ist ein aktives Klasse II Element im heterologen Wirt N. crassa. Es wurden Exzisionsereignisse mittels PCR-Analysen nachgewiesen. Restless exzisiert sowohl korrekt als auch inkorrekt. Die korrekte Restless-Exzision hinterließ keine „footprints“, so daß die ursprüngliche „Wildtyp-Situation“ wiederhergestellt wurde. Bei der inkorrekten Exzision blieben terminale DNA-Bereiche des Transposons nach der Exzision zurück. N. crassa-Isolate, bei denen diese Exzisionen nachgewiesen wurden, konnten durch zwei unabhängige Selektionssysteme erzielt werden, eine „Vorwärts-Selektion“ und eine dominante Selektion. Beide Selektionssysteme ergaben Isolate, in denen identische Exzisionsprodukte ermittelt wurden. 5. In dem heterologen Wirt Neurospora crassa aber auch im homologen System Tolypocladium inflatum konnten erstmals Derivate des Transposons Restless mit internen Deletionen ermittelt werden. Diese Derivate sind vermutlich das Ergebnis einer inkorrekten Exzision von Restless, bei der interne Bereiche unterschiedlicher Größe zwischen repetitiven DNA-Sequenzen verloren gegangen sind. Der Aufbau und die Entstehung dieser (Rst-Elemente weisen deutliche Homologien zu den Ds-Elementen aus dem Mais auf. 6. Durch den Nachweis veränderter Hybridisierungsmuster bei verschiedenen N. crassa Isolaten konnten erstmals in einem heterologen Organismus putative Transpositionsereignisse für das Restless-Element nachgewiesen werden. Ausgehend von Transformanten mit einer einzelnen Restless-Kopie traten zusätzliche Banden bei der Southern-Hybridisierung auf. Das Restless-Element transponiert somit vermutlich bevorzugt während der Replikation. Dieser Mechanismus der Transposition wurde bereits für das Activator-Elemente im Mais nachgewiesen. In dieser Arbeit wird erstmals die Aktivität des Transposons Restless in dem Hyphenpilz Neurospora crassa beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Transposition von Restless ein sehr komplexer Vorgang ist, der von sehr unterschiedlichen Faktoren beeinflußt wird. Neben einer korrekten Restless-Sequenz muß die Methylierung repetitiver Sequenzen, die Effektivität des alternativen Spleißens und der Zeitpunkt der Restless-Transposition in dem heterologen System N. crassa berücksichtigt werden. Bei einer Optimierung der Restless-Aktivität unter Berücksichtigung dieser Faktoren können die Grundlagen geschaffen werden, das Transposon Restless als molekulares Werkzeug für die Etablierung eines Transposon-Mutagenese-Systems zu verwenden.

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