Autor: Katharina Bakhaus

Sulfatierte Steroide sind aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften im Gegensatz zu den unkonjugierten Steroiden nicht in der Lage, eigenständig die Zellmembran mittels Diffusion zu durchdringen. Sie sind daher auf Transportsysteme angewiesen, die sie in die Zielzelle hineinbringen. Innerhalb der Zelle können sie von der StS in freie, hormonell aktive Form überführt werden, über den spezifische Rezeptoren mit der DNA interagieren und eine hormonelle Zellantwort initieren und modulieren. Dieser sogenannte Sulfatase Pathway wird in der Literatur als alternativer Weg der Steroidhormonversorgung in intrakrinologisch aktiven Organen wie dem Hoden oder der Haut diskutiert und in den Zusammenhang mit pathologischen Befunden wie dem hormonabhängigen Mammakarzinom in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit wurden der Sulfatase Pathway im Hoden untersucht. Hierzu wurden vier potentielle Kandidatentransporter (OATP6A1, OATP1C1, OSCP1 und SOAT) ausgewählt und in Expressionsanalysen und Transportstudien näher charakterisiert. Es zeigte sich, dass alle vier ausgewählten Transportproteine eine prädominante, oder im Fall des OATP1C1, dominante Expression im Hoden aufwiesen. Im Rahmen der funtionellen Charakterisierung stellte sich heraus, dass SOAT der vielversprechendste Kandidat für die Einbindung in den Sulfatase Pathway darstellte. Sowohl die beiden OATP-Proteine wie auch das OSCP1-Protein zeigten in den durchgeführten Transportstudien weder in stabil transfizierten HEK293-Zellen, noch im Xenopus laevis Oozyten-Expressionsmodell eine Transportaktivität für die sulfatierten Steroide DHEAS und E1S, so dass von einer weiteren Untersuchung dieser Proteine abgesehen wurde. SOAT hingegen transportiert eine Vielzahl sulfatierter Steroide. Um sein Substratspektrum zu erweitern, wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. S. Wudy, Gießen, die LC-MS/MS für die Analyse sulfatierter Steroide aus Zelllysaten etabliert. Mit Hilfe dieser neuen analytischen Möglichkeit wurde erstmals gezeigt, dass SOAT intakte Steroidsulfate in HEK293-Zellen hineintransportiert. Ferner konnten mit E2S und Androstendiol-3-sulfat zwei neue Substrate des SOAT-Proteins identifiziert werden. Beim Einsatz von Steroidmixen, die E1S, PREGS und DHEAS in wechselnden Konzentrationen enthielten zeigte sich eine, von der Konzentration der Substanz in der Messlösung abhängige Aufnahme der Substrate. Die Aufnahme von E1S kann außerdem durch freies E1 gesteigert werden, wohingegen Testosteron keinen Einfluss auf die Aufnahmemenge der einzelnen Steroidsulfate zur Folge hatte. Diese Daten zeigen, dass sowohl E1S wie auch PREGS und DHEAS ago-allosterische Modulatoren des SOAT-Proteins darstellen. Die LC-MS/MS ermöglichte somit weitere Einblicke in das Transportverhalten des SOAT-Proteins unter physiologischen Bedingungen und stellt ein neues Analyse-Tool für die Identifizierung weiterer Substrate des SOATs dar. Neben der Untersuchung des SOAT-Wildtyp-Proteins erfolgte auch die Evaluierung verschiedener natürlich vorkommender SNPs im SLC10A6-Gen. Hierbei wurde beim SOAT-L204F-Polymorphismus eine signifikant erniedrigte maximale Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zum SOAT-Wildtyp festgestellt, die vermutlich durch eine unzureichende Sortierung des polymorphen Proteins in die Zellmembran der untersuchten HEK293-Zellen hervorgerufen wird. Die Lokalisation der SOAT-Proteine erfolgte mit dem anti-SOAT311-377 Antikörper, der im Rahmen dieser Arbeit sowohl für den Western Blot als auch für die Immunfluoreszenz validiert wurde. Das membranständige SOAT-Protein wurde mit dem SOAT2-17 Antiserum detektiert und ermöglichte die Kontrolle des Sortierungsprozesses der SOAT-Varianten. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass SOAT ein breites Spektrum an intakten Steroidsulfaten Natrium-abhängig in die Zellen transportiert und auf Konzentrationsänderungen in Steroidgemischen mit einer Anpassung seines Transportverhaltens reagiert. Die Aufnahme der Steroidsulfate kann außerdem durch freie Steroide moduliert werden. In vorläufigen Experimenten konnte CS als weiteres potentielles Substrat identifiziert werden. Aufgrund der exklusiven Expression des SOATs im Hoden, die ausschließlich in den Keimzellen stattfindet, und seinem sehr selektives Substratspektrum ist von einer wichtigen physiologischen Funktion dieses Proteins im Hoden auszugehen. Hierfür spricht auch seine reduzierte Expression in verschiedenen Formen der gestörten Spermatogenese und das Auftreten funktionell veränderter SNPs. Seine deutliche Expression in der Haut deutet auch in diesem, intrakrinologisch aktivem Organ auf eine bedeutende Funktion im Rahmen der lokalen Steroidhormonversorgung hin. Um nun die physiologische und pathologische Bedeutung des SOATs final zu klären, wurde ein Slc10a6-Knockout-Maus-Modell generiert, was in weiterführenden Studien vor allem in Hinblick auf den Hoden, die Haut und den Steroidmetabolismus charakterisiert werden soll. SOAT hat das Potential zum Drug Target, was durch diese Arbeit bekräftigt werden konnte. Das Slc10a6-Knockout-Maus-Modell wird hierzu weitere Erkenntnisse liefern, die es ermöglichen SOAT als Drug Target zu nutzen.