Autor: Franziska Nippert

Neonatale Kardiomyozyten können mittels Mitose regenerieren, verlieren jedoch diese Fähigkeit innerhalb der ersten postnatalen Woche. Adulte Kardiomyozyten sind terminal ausdifferenziert und können nicht mehr proliferieren. Dennoch müssen diese Zellen in der Lage sein, sich an Stresssituationen wie Ischämie, aterielle Hypertonie, Zellverlust und Altern anzupassen. Kürzlich veröffentlichte Studien implizierten, dass die De- und Redifferenzierung eine entscheidende Rolle im Rahmen der Anpassung adulter Kardiomyozyten an kardiale Stresssituationen spielen könnten. Die Prozesse der De- und Redifferenzierung können unter Kulturbedingungen analysiert werden. Während der De- und Redifferenzierung der adulten Kardiomyozyten ist eine Reexpression von fetalen Genen, wie der schweren Kette des beta-Myosins (β-MHC), des Transkriptionsfaktors Gata 4 oder des Homeobox Proteins Nkx 2.5 nachweisbar. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass das Zytokin Onkostatin M (OSM) eine wichtige Rolle in der De- differenzierung adulter Kardiomyozyten spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Renin und Swiprosin-1 eine entscheidende Rolle in der De- und Redifferenzierung von adulten Kardiomyozyten des Rattenherzens einnehmen. Renin ist eine Apartat-Protease, welche über das bekannte Renin-Angiotensin-Aldosteron System eine entscheidende Wirkung auf die Blutdruckregulation des Körpers von Mensch und Säugetier besitzt. Zusätzlich konnte bei früheren Forschungen mittels Renin eine verlängernde Wirkung auf adulte Kardiomyozyten gezeigt werden. Swiprosin-1, auch bekannt als EF hand domain family member D2 (EFHD2), ist ein kürzlich entdecktes, Aktin-bindendes Protein, welches Kalzium für seine Dimerisierung zur aktiven Form benötigt. Funktionell blockiert Swiprosin-1 in seiner aktivierten Form als Dimer die Bindungsstelle von Cofilin an F-Aktin. Cofilin wird für die Depolymerisation von F-Aktin benötigt. Zusätzlich könnte auch der kardiale Transkriptionsfaktor Myocyte-specific enhancer factor 2c (Mef2c), der eine wichtige Funktion in der Myogenese in neonatalen Kardiomyozyten spielt, einen Einfluss auf die Prozesse der De- und Redifferenzierung in adulten Kardiomyozyten ausüben. Während der De- und Redifferenzierung in vitro konnten dabei Eigenschaften nachgewiesen werden, die auch während des kardialen „remodeling“ in vivo sichtbar sind. Ein wichtiger Mechanismus des kardialen „remodeling“ ist die β-adrenerge Desensibilisierung. Diese führt chronisch zu einer verschlechterten kardialen Funktion und Progression von maladaptiven kardialen Prozessen. Unter akuten Bedingungen besitzt die β-adrenerge Desensibilisierung jedoch einen schützen- den Effekt. Für die vorliegende Arbeit wurden adulte, ventrikuläre Kardiomyozyten der Ratte isoliert und für sechs Tage in 20% fetalem Kälberserum kultiviert. Die morphologischen Veränderungen der adulten Kardiomyozyten während der Kultivierung wurden mittels konfokaler Lasermikroskopie und Fluoreszenzmarkierung des F-Aktins mit Phalloidin-TRITC dokumentiert. Zusätzlich kam small interfering RNA (siRNA) zur Hemmung der Translation von Swiprosin-1 und Mef2c zum Einsatz. Der Einfluss von Kalzium auf Swiprosin-1 wurde durch die Verwendung von A23187, Bapta-AM, Ionomycin und Verapamil untersucht, welche zu einer Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration führen. Um eine Expression auf Protein- oder mRNA- Ebene zu messen, wurden Western Blot Analysen und quantitative real time Polymerase- Ketten-Reaktionen (qRT-PCR) durchgeführt. Des Weiteren wurden Experimente mit lastfreier Zellverkürzung zur Messung der Kontraktionsfähigkeit adulter Kardiomyozyten unter verschiedenen Bedingungen vollzogen. In in vivo Experimenten mit den kardialen Stresssituationen „Ischämie/Reperfusion“, induziert durch 30-minütige Ligatur des Ramus interventricularis anterior (LAD-Ligatur) bei weiblichen Wistar Ratten, und „chronische Hypertonie“, untersucht bei weiblichen spontan hypertensive Ratten (SHR), erfolgte eine Detektion der Swiprosin-1 Expression auf mRNA-Ebene. Mit der vorliegenden Studie konnte die Kultivierung von adulten Kardiomyozyten, wie sie schon in den 80er Jahren beschrieben wurde, erfolgreich reetabliert werden. Adulte Kardiomyozyten zeigten eine starke morphologische Veränderung während der sechstägigen Kultivierung. Die ursprünglich stäbchenförmigen Zellen rundeten in den ersten Tagen der Kultivierung ab und es kam zu einem Verlust des geordneten kontraktilen Apparates. Dies war gefolgt von der Ausbildung von Pseudopodia-ähnlichen Strukturen („spreading“) und einem Wiederaufbau des kontraktilen Apparates (ab Tag 3). Zunächst kam es zur Formation von Aktinstressfasern, die in der ganzen Zelle nachweisbar waren. Entlang dieser Stressfasern wurden neue Sarkomere geformt, sodass am Ende der Kultivierungszeit (Tag 6) die typische Querstreifung in den kultivierten, adulten Kardiomyozyten mittels Fluoreszenzmarkierung mit Phalloidin-TRITC wieder sichtbar wurde. Diese phänotypische Veränderung wurde begleitet von einer Reexpression der fetalen Gene β-MHC, Gata 4 und Nkx 2.5. Zusätzlich konnte ein Anstieg in der mRNA Expression von Onkostatin M nachgewiesen werden. Innerhalb von sechs Tagen konnte somit eine De- und Redifferenzierung adulter Kardiomyozyten unter Kulturbedingungen nachgewiesen werden. Mit der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal Swiprosin-1 in adulten Kardiomyozyten zu allen gemessenen Zeitpunkten nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression von Swiprosin-1 mit Beginn des „spreading“ in diesen Zellen. Mittels Swiprosin-1-spezifischer siRNA konnte das „spreading“ verlangsamt werden. Zusätzlich induzierten sowohl Bapta-AM und Verapamil als auch Ionomycin eine Verminderung in der Expression von Swiprosin-1 auf Proteinebene und reduzierten die Formation von Pseudopodia-ähnlichen Strukturen im Vergleich zu Kontrollbedingungen. Des Weiteren konnte mit Verapamil und teilweise Ionomycin ein veränderter Abbau des kontraktilen Apparates während der Dedifferenzierung detektiert werden. Unter den kardialen Stresssituationen „chronische Hypertonie“ und „Ischämie/Reperfusion“ war eine vermehrte mRNA Expression von Swiprosin-1 nachweisbar. Zusätzlich korrelierte die Expression von Swiprosin-1 auf mRNA-Ebene mit Proteinen, die eine entscheidende Rolle in der β-adrenergen Desensibilisierung spielen. Vor allem mit GRK2 war sowohl in vivo als auch in vitro eine hochsignifikante Korrelation nachweisbar. Dabei führte eine Hemmung der Swiprosin-1 Expression zu einer Herabregulation von GRK2 auf Proteinebene und induzierte eine Sensibilisierung der β-adrenergen Rezeptoren. Renin beschleunigte ebenfalls das „spreading“ adulter Kardiomyozyten in Primärkultur. Weiterhin konnte bestätigt werden, dass Renin seine Effekte über den M6P/IGFII Rezeptor und die nachgeschaltete Signalkaksade der p44/p42 MAPK vermittelt. Durch die Hemmung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Kinase (MEK1/2), welche die p44/p42 MAPK phosphoryliert, mittels PD98059 war ein vermindertes „spreading“ in adulten Kardiomyozyten nachweis- bar. Interessanterweise konnte ebenfalls eine Regulation von Swiprosin-1 durch die p44/p42 MAPK gezeigt werden. Renin zeigte jedoch im direkten Vergleich zu Kontrollbedingungen keinen Einfluss auf die Expression von Swiprosin-1 auf mRNA- oder Proteinebene. Für Mef2c konnte keine Regulation durch Renin und keine Beteiligung an der Ausbildung von Pseudopodia-ähnlichen Strukturen in adulten Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass Renin neben seiner entscheidenden Funktion im Renin-Angiotensin-Aldosteron System eine wichtige Rolle in der De- und Redifferenzierung von adulten Kardiomyozyten zu spielen scheint. Es vermittelt seine Wirkung jedoch nicht über Swiprosin-1 oder Mef2c. Swiprosin-1 könnte eine entscheidende Funktion in der Anpassungsfähigkeit von adulten Kardiomyozyten an Kulturbedingungen und an kardiale Stresssituationen in vivo besitzen. Es spielt eine wichtige Rolle in der De- und Redifferenzierung adulter Kardiomyozyten und der β-adrenergen Desensibilisierung. Zusätzlich ist es unter den kardialen Stresssituationen „chronische Hypertonie“ und „Ischämie/Reperfusion“ induziert. Somit ist es vorstellbar, dass Swiprosin-1 unter akuten Bedingungen eine schützende Funktion auf die Kardiomyozyten zeigt, während es unter chronischen Bedingungen den maladaptiven Prozess des kardialen „remodeling“ verstärkt.