Autor: Fabian Johannes Pflieger

Eine systemische Entzündung verläuft in einem homöostatischen Prozess, um zuerst Entzündungserreger zu eliminieren und anschließend die Gewebefunktion wiederherzustellen. Systemische Entzündungen lösen auch Neuroinflammation aus. Über die Kommunikation zwischen Immunsystem und Gehirn kommt es dabei zur Ausbildung zentralnervös-kontrollierter Krankheitssymptome wie Fieber, Lethargie, Anorexie und Adipsie. Sepsis ist eine schwere Form der systemischen Entzündung bei der lebende Pathogene in den Blutkreislauf übertreten. Sie geht bei Mensch und Tier mit hoher Sterblichkeit einher. Überlebende leiden häufig unter anhaltenden kognitiven Einschränkungen. Lipidmediatoren wie Prostaglandin (PG)E2 fördern die pro-inflammatorische Aktivierung während der Entzündungsreaktion. Die lokale PGE2-Produktion in der präoptischen Region des Hypothalamus (POA) induziert Fieber. Der anfängliche PGE2-Peak dient aber auch als Wendepunkt der Entzündung, da er einen Lipidmediator-Klassenwechsel signalisiert. Dabei induziert PGE2 die Expression von Enzymen, welche spezialisierte pro-entzündungsauflösende Mediatoren (SPMs) synthetisieren. Die Entzündungsauflösung ist ein aktiver Prozess, der durch die Produktion spezifischer Lipidmediatoren wie SPMs koordiniert wird, indem diese Mediatoren beispielsweise die Rekrutierung von Immunzellen reduzieren und die Phagozytose verstärken. Die meisten SPMs entstehen aus Omega (ω)-3-Fettsäuren (FS). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von ω-3-FS zum einen auf den Verlauf von Lipopolysaccharid (LPS)-induzierter systemischer Entzündung, Neuroinflammation, Kommunikation zwischen Immunsystem und Gehirn und Krankheitssymptomen und zum anderen auf die Stressreaktion einer neuen Umgebung mittels Käfigwechsels untersucht. Um eine ω-3-FS-Defizienz oder –Anreicherung zu modellieren wurden die Mäuse unter einer ω-3-FS-defizienten Diät oder einer ω-3-FS-suffizienten Standarddiät gehalten und C57BL/6 (WT)-Mäuse mit transgenen fat-1-Mäusen, die endogen ω-3-FS produzieren können, verglichen. Um die Ausprägung von Krankheitssymptomen zu erfassen diente ein telemetrisches System mit kontinuierlicher Aufzeichnung der Körperkerntemperatur, der lokomotorischen Aktivität, sowie der Futter- und Wasseraufnahme. 5 oder 24 h nach intraperitonealer Injektion von LPS (50µg/kg, 2,5 mg/kg) wurden die Tiere perfundiert und Gehirne, Blutplasma und Leberproben für eine multimodale Analyse gewonnen. Zytokin-Immun- und Bioassays wurden bei Blut- und Leberproben angewendet, um den Status der systemischen Entzündung zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden anschließend mit detaillierten Analysen der Neuroinflammation im Hypothalamus unter Verwendung von q-„real time“-PCR für die Bestimmung der mRNA-Expression von Entzündungsmarkern sowie Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LCMS/MS) kombiniert, um die Produktionswege von Lipidmediatoren und Lipidzusammensetzung zu untersuchen. Wegen der zentralen Rolle des hypothalamischen Organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) bei der Fieberentstehung wurden auch räumliche Verteilungsmuster und die Lipidzusammensetzung des OVLTs mittels hochauflösender, bildgebender Matrix-assistierter Laserdesorptions-Ionisation Massenspektrometrie (MALDI-MSI) untersucht. Die ω-3-FS-defizienten WT- und fat-1-Mäuse entwickelten LPS-dosisabhängig Fieber- und „sickness behaviour“, das bei WT- und fat-1-Mäusen ähnlich ausgeprägt war. Bei ω-3-FS-suffizienten Tieren verursachte die hohe LPS-Dosis bei WT-Mäusen kurz anhaltendes Fieber, während bei fat-1-Mäusen kein Fieber auftrat. Diese entwickelten stattdessen im Vergleich zu PBS-behandelten fat-1-Kontrolltieren eine milde transiente Hypothermie. Bei beiden Mausstämmen wurde allerdings ein ähnlich reduziertes Körpergewicht, verminderte motorischer Aktivität sowie reduzierte Nahrungs- und Wasseraufnahme im Verlauf der Entzündung beobachtet. Die systemische Freisetzung von entzündlichen Zytokinen und die lokale Aktivierung neuroinflammatorischer Signalwege im Hypothalamus waren bei ω-3-defizienten und -suffizienten WT-Mäusen ähnlich, was darauf hindeutet, dass ein ω-3-FS-Mangel die Entzündungsreaktion in dem verwendeten Modell nicht wesentlich verstärkte. Der fat-1-Genotyp veränderte den Verlauf der Entzündung in den ω-3-defizienten Gruppen nicht. Bei ω-3-FS-suffizienten Tieren waren die LPS-induzierten pro-inflammatorischen Marker signifikant geringer erhöht als bei WT-Mäusen, was darauf hinweist, dass die Entzündungsauflösung in fat-1-Mäusen beschleunigt war. In der Tat wies die Zytokinproduktion in fat-1-Mäusen eine geringere Freisetzung von Tumornekrosefaktor (TNF) α und Interleukin (IL)-6 aus Leberhomogenaten in den Gruppen 5 h post injectionem (p.i.) auf. Darüber hinaus war die LPS-induzierte Plasma-IL-6-Bioaktivität in fat-1-Mäusen 24 h nach LPS-Stimulation signifikant niedriger als in WT-Mäusen. „Suppressor of cytokine signaling 3“- und „Inhibitor of κBα“-mRNA-Expression waren außerdem Zeichen geringerer Aktivierung des „signal transducer and activator of transcription 3“- und des „Nuclear factor“ (NF)-κB-Signalweges in fat-1-Mäusen gegenüber WT-Mäusen 24 h nach LPS-Injektion. Interessanterweise war die mRNA-Expression von „Toll-like-Rezeptor-4“ (TLR4) bei fat-1-Mäusen insgesamt verringert, während sie bei LPS-behandelten WT-Mäusen zunahm. Dies deutet darauf hin, dass der LPS-TLR4-NFκB-Weg in fat-1- vs. WT-Mäusen schwächer aktiviert sein könnte. Phospholipide als Substrate für die FS-Freisetzung wurden durch „untargeted“ Lipidomics mittels LCMS/MS in Hypothalamus-Homogenaten analysiert, um die Stoffwechselwege der Lipidmediatoren zu untersuchen. Messungen ergaben in fat-1-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant erhöhte Messwerte von Phospholipiden, welche ω-3-FS beinhalteten und signifikant verringerte massenspektrometrische Intensitäten von ω-6-FS-tragenden Phospholipiden. Diese Ergebnisse validieren das fat-1-Mausmodell mit erhöhten ω-3- und verringerten ω-6-FS-Lipiden im Hypothalamus. Die Freisetzung von FS aus den Phospholipiden der Zellmembranen wurde (a) durch Überprüfung der mRNA-Expression der Phospholipase A2 (PLA2g4a) und (b) durch „targeted“ LCMS/MS-Messungen von ω-6-Arachidonsäure (AA) untersucht. In der Tat ging (a) eine signifikant niedrigere mRNA-Expression von PLA2g4a in fat-1-Mäusen mit einer (b) geringeren Freisetzung von AA in LPS-behandelten fat-1- gegenüber WT-Mäusen (5 h p.i.) einher. Wie erwartet wurde der Eicosanoid-Metabolismus nach LPS-Stimulation über Cyclooxygenase-2 und microsomale-Prostaglandin-E-Synthase (mPGES) im Verlauf der Entzündung aktiviert. Allerdings deutete 24 Stunden nach der LPS-Stimulation eine verringerte mRNA-Expression von mPGES in fat-1- gegenüber WT-Mäusen auf eine geringere PGE2-Synthese in fat-1-Mäusen hin. Die PGE2-Konzentrationen („targeted“ LCMS/MS) waren jedoch in fat-1- gegenüber WT-Mäusen 5 h nach LPS-Stimulation lediglich tendenziell verringert. Zusätzlich zur Anreicherung von ω-3-FS-tragenden Lipiden wurden Genotyp-spezifisch erhöhte Konzentrationen der Eicosapentaensäure (EPA) im Hypothalamus von fat-1-Mäusen mittels LCMS/MS nachgewiesen. Die mRNA-Expression der Lipoxygenasen (LOX) ALOX5 und ALOX15 stiegen zum 24-h-Zeitpunkt in den LPS-Gruppen an. Darüber hinaus waren die Mengen von Resolvin D1 im Hypothalamus von LPS-behandelten fat-1- gegenüber WT-Mäusen zum 24-h-Zeitpunkt signifikant erhöht, was durch eine erhöhte Synthese des ω-3-SPM, Resolvin D1 über ALOX5/15 in fat-1-Mäusen erklärt werden kann. Daher scheint die Produktion von Resolvinen und anderen SPMs über LOX ein Schlüsselfaktor für eine verstärkte Entzündungsauflösung in fat-1-Mäusen darzustellen. Die mRNA-Expression von CD163, einem Marker für perivaskuläre Makrophagen, und des für neutrophile Granulozyten spezifischen Chemokins „C-X-C motif ligand 1“ war 24 h nach LPS-Injektion in fat-1-Mäusen signifikant niedriger als in WT-Mäusen, was auf eine LPS-induziert geringere Rekrutierung von Monozyten und Neutrophilen in fat-1-Mäusen hinweist. Bemerkenswerterweise war die mittels „targeted“ LCMS/MS bestimmte Leukotrien (LT)B4-Konzentration im Hypothalamus von fat-1- gegenüber WT-Mäusen Genotyp-spezifisch zum 5-h-Zeitpunkt erniedrigt. Der pro-inflammatorische Lipidmediator LTB4 kann Neutrophile anziehen und aktivieren. Eine verringerte mRNA-Expression von ALOX5-„activating protein“ in fat-1-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen könnte mit der verringerten LTB4-Konzentration zusammenhängen, da ALOX5-„activating protein“ die LT-Synthese fördert. Insgesamt unterstützen all diese Erkenntnisse die Hypothese einer verminderten Rekrutierung von Immunzellen in das Gehirn von fat-1-Mäusen während einer LPS-induzierten systemischen Entzündung. Explorative „untargeted“ LCMS/MS-Lipidomics und ein selbst entwickeltes „Data-Mining“-Protokoll ergaben Veränderungen mehrerer Lipidsignalwege im Verlauf der hypothalamischen Neuroinflammation, von denen einige hier zusammengefasst sind. Ein bemerkenswerter Anstieg der potenziell anti-inflammatorischen Endocannabinoide Monoglycerin (MG) (20:4) und MG (22:6) in fat-1- gegenüber WT-Mäusen 24 h nach der LPS-Injektion legen ω-3-FS-assoziierte Veränderungen der Endocannabinoidsystems nahe. Phosphatidylcholin (PC) (16:0_18:2) wurde bereits mit anti-inflammatorischer Wirkung in Verbindung gebracht und war in LPS-Gruppen 24 h p.i. erhöht. Das ω-3-EPA-tragende PC(16:0_20:5) war im Gehirn von fat-1-Mäusen generell erhöht und legt daher ein anti-inflammatorisches Potenzial dieses Moleküls nahe. Zahlreiche Lipidspezies waren durch die LPS-induzierten Entzündung im Hypothalamus angestiegen. Der Literatur-„Mining“-Prozess half dabei, diese Kandidaten mit Ergebnissen früherer Omics-Studien zu Entzündungen in Relation zu stellen. Acylcarnitin (Car) (16:0), Linolsäure (LA), PC(16:0_16:1) und Ceramid(t18:0_16:0) waren die vielversprechendsten Marker, die sich aufgrund der LPS-induzierten Entzündung bei WT-Mäusen veränderten. Da Car(16:0) Entzündungskaskaden modulieren kann und LA-Metabolite pro- oder anti-inflammatorische Wirkungen besitzen, könnte ihr vermehrtes Auftreten demnach eine wichtige Rolle bei systemischen und neurologischen Entzündungsprozessen spielen. Andere pro-inflammatorische Lipide, wie PC(16:0_20:4) und Lyso-(L) PC(20:4), zeigten in fat-1-Mäusen vs. WT-Mäusen im Hypothalamus niedrigere Konzentrationen. Hingegen wies das Astrogliose-induzierende LPC(18:1) hohe Intensitäten im Hypothalamus von LPS-behandelten fat-1-Mäusen auf. Darüber hinaus stiegen die Lipide der Klassen Acylcarnitine und Triglyceride (TG) durch die LPS-Behandlung im Hypothalamus an. Dieses vermehrte Auftreten könnte mit einer Verschiebung des Energiestoffwechsels in Richtung β-Oxidation oder einem pro-inflammatorischen Potenzial zusammenhängen. Die erhöhten TG-Spezies in den Messungen wiesen nämlich einen hohen LA-Gehalt auf. Acylcarnitine zeigten außerdem in vorangegangen Studien eine Modulation von inflammatorischen Signalwegen und Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. Die LCMS/MS-Daten des Hypothalamus wurden mittels MALDI-MSI-Messungen auf histologische Gehirnschnitte der POA erweitert. Die Analyse der Lipidverteilungsmuster in der POA ergab visuell sowie über eine Hauptkomponentenanalyse mehr als drei unterschiedliche regionale Lipidmuster etwa für das OVLT, die Sehnerven und die graue Substanz der POA. Bei der Entwicklung eines post MALDI-MSI-Immunhistochemie-Protokolls identifizierten wir ferner Lipidsignale (z.B. Sphingomyelin (d34:1)), die vermutlich von Endothelzellen und Astrozyten aus dem gemessenen MALDI-MSI-Bereich des zentralen OVLT stammten. Darüber hinaus wurden nach Goldstandardmethodik LCMS/MS mit MALDI-MS/MS kombiniert, um die Lipidpeaks aus MALDI-MSI-Daten zu bestätigen, sodass wir innovativ entwickelte Methoden zur Normalisierung und Quantifizierung auf MALDI-MSI-Lipidpeaks aus dem Messbereich des OVLT („region of interest“) anwenden konnten. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Intensitäten spezifischer Lipide je nach Genotyp und/oder Behandlungsgruppe ändern. Im zentralen OVLT waren LPC(18:1), LPC(20:4) und ω-6-FS-tragende Phospholipide, z.B. PC(16:0_20:4) verringert, während EPA-tragendes PC(16:0_20:5) erhöht in fat-1-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen detektiert werden konnte. Car(16:0) stieg aufgrund der LPS-induzierten Entzündung in allen Gruppen an, hatte aber außerdem generell höhere Intensitäten in fat-1- vs. WT-Mäusen, was auf seine mögliche Rolle bei inflammatorischen und thermoregulatorischen Veränderungen wie unterdrücktem Fieber in fat-1-Mäusen hinweist. Bemerkenswerterweise wurden in fat-1-Mäusen vs. WT-Mäusen erhöhte MG(20:4) und MG(22:6)-Messwerte von einer verringerten Monoacylglycerol-Lipase (MGLL)-mRNA-Expression im Hypothalamus begleitet, was vermehrtes Auftreten der Endocannabinoide aufgrund eines verringerten Abbaus durch die MGLL erklären könnte. Interessanterweise modulieren Endocannabinoide nicht nur inflammatorische Prozesse, sondern verändern auch die neuronale Signalübertragung über Aktivität an Cannabinoid- und "transient receptor potential cation channel subfamily V member 1" (TRPV1) -Rezeptoren im ZNS. Deshalb könnte die inflammatorische Signalübertragung und Thermogenese von fat-1-Mäusen verändert sein. Die stressinduzierte Thermoregulation wurde ebenfalls durch die PUFA-Zusammensetzung beeinflusst. Käfigwechsel, ein Stress-Modell durch eine neue Umgebung (NES), resultierte in einer stärker erhöhten Stress-induzierten Hyperthermie in fat-1-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen. Darüber hinaus verlängerte eine ω-3-FS-Defizienz die stressinduzierte Hyperthermie im Vergleich zu ω-3-FS-suffizienten Mäusen, was eine erhöhte Stressanfälligkeit durch einen bereits pränatal bestehenden ω-3-FS-Mangel belegt. Insgesamt wurden neue entzündliche Lipidmoleküle wie Acylcarnitine (Car(16: 0)), LA-Metabolite sowie ω-3-Endocannabinoide (MG22:6) nachgewiesen, die alle Inflammation modulieren können. Ihre Rolle bei Neuroinflammation und zentralnervös-kontrollierten Krankheitssymptomen sollte zukünftig weiter untersucht werden. Thermoregulation als Reaktion auf eine entzündliche (LPS) oder psychologische Belastung (NES) war in fat-1-Mäusen verändert, was sich in verstärkter NES-induzierter Hyperthermie, und Hypothermie nach LPS-Stimulation wiederspiegelt. Letzteres steht im Zusammenhang mit einer beeinträchtigen PGE2- und einer begünstigten SPM-Lipidmediatorensynthese in fat-1-Mäusen. Während Hypothermie anstelle von Fieber in WT-Mäusen sowie erhöhte IL-1β- und IFNγ-Plasmakonzentrationen zu Beginn der LPS-induzierten Entzündung bei fat-1-Mäusen ein Zeichen für eine stärkere Entzündung sein könnten, spricht die Mehrzahl der vorliegenden Daten eher für eine gedämpfte Entzündungsreaktion und verbesserte Entzündungsauflösung in fat-1- vs. WT-Mäusen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anreicherung von ω-3-FS die Auflösung von Entzündungen durch pro-entzündungsauflösende und anti-inflammatorische Mechanismen fördert. Dies beinhaltet die Produktion von SPMs wie Resolvin D1 und deren Vorläufern wie PC(16:0_20:5). Untersuchungen der physiologischen in-vivo-Daten und Zytokinmessungen kombiniert mit der mRNA-Expression von Entzündungsmarkerproteinen und Enzymen, die am Lipidmediator-Metabolismus beteiligt sind, wurden mit weiteren Lipidanalysen kombiniert. Diese beinhalteten „targeted“ LCMS/MS, „untargeted“ Lipidomics und MALDI-MSI in Strukturen des Hypothalamus. Insgesamt ergaben diese multimodalen Analysen neue Einblicke in die Verteilungsmuster sowie die Dynamik von Lipiden und die Rolle von Lipidmediatoren bei Gehirnentzündungen und Kommunikationswegen zwischen Immunsystem und Gehirn.