Antimikrobielle Peptide (AMPs) von Insekten sind wertvolle Ressourcen für die pharmazeutische Industrie und können als Leitstrukturen für die Entwicklung neuartiger Antibiotika dienen. Um dieses Potenzial zu nutzen, ist eine effiziente rekombinante Expression erforderlich. Die Etablierung einer diesbezüglichen Herstellungsplattform umfasst sowohl die Auswahl eines geeigneten Expressionswirts als auch die Prozessoptimierung während des späteren Scale-Ups. Die vorliegende Arbeit beschreibt die rekombinante Herstellung von zwei AMPs, die ursprünglich aus der großen Wachsmotte Galleria mellonella bzw. dem asiatischen Marienkäfer Harmonia axyridis isoliert wurden. Als Expressionswirt wurden stabil transfizierte Drosophila melanogaster S2-Zellen eingesetzt. Basierend auf der polyklonalen Population, die nach der Transfektion vorlag, konnten mittels Limiting Dilution hochproduktive Einzelzellklone isoliert werden, welche typischerweise eine zwei- bis sechsfach höhere zellspezifische Produktivität aufwiesen. Im Zuge einer weiteren Optimierung wurde ein statistisch geplantes Screening zur Bestimmung der optimalen Induktionsbedingungen durchgeführt. Während des anschließenden Scale-Ups in den 1L-Bioreaktor-Maßstab ermöglichte die Online-Messung der dielektrischen Eigenschaften der Zellsuspension sowie die Messung der vorliegenden Trübung eine effiziente Prozesskontrolle. Basierend darauf wurden in ersten Batch- oder Fed-Batch-Prozessen 17 bis 30 mg der AMPs produziert. Eine weitere Prozessintensivierung erfolgte durch den Wechsel zu einem TFF-basierten Perfusionsprozess. Dadurch konnte die Proteinausbeute bereits in einem sehr kurzen Pilotversuch auf 130 mg erhöht werden. Schließlich wurden die funktionellen AMPs aufgereinigt und hinsichtlich ihrer Aktivität getestet.
Aktualisiert: 2020-01-28
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Die Bekämpfung antibiotikaresistenter Krankheitserreger, deren Verbreitung immer weiter zunimmt, könnte zukünftig durch antimikrobielle Peptide (AMPs) gelingen. Insbesondere AMPs aus Insekten sind aufgrund ihrer Diversität vielversprechende pharmazeutische Kandidatenmoleküle. Die potentielle pharmazeutische Anwendung erfordert für entsprechende Charakterisierungen und klinische Studien eine Produktion der AMPs in ausreichenden Mengen und hoher Reinheit. Die rekombinante Proteinproduktion mit Escherichia coli (E. coli) ist im industriellen Maßstab etabliert und kann für kleine Proteine ohne komplexe posttranslationale Modifikationen gut umgesetzt werden. Im Fall der Produktion von AMPs besteht jedoch das Risiko einer toxischen Wirkung des Zielproteins auf den Expressionsorganismus. In dieser Arbeit sollte daher eine Methodik etabliert werden, bei der AMPs in unlöslichen inclusion bodies (IBs) akkumuliert werden, sodass der Expressionsorganismus vor einer eventuellen Toxizität geschützt ist. Außerdem sollte die Produktaufarbeitung der IBs im Vergleich zu klassischen Methoden vereinfacht und möglichst für alle Zielproteine vereinheitlicht werden. Zu diesem Zweck wurde für die IB-basierte Produktion ein pull-down tag verwendet, das durch die Fusion an ein Zielprotein dessen Akkumulation in IBs bewirkt und zugleich eine pH-abhängige Resolubilisierung dieser IBs ermöglicht.
Zum Vergleich der IB-basierten Produktion und Produktaufarbeitung mit einer löslichen Produktion und der entsprechenden Produktaufarbeitung wurde der Insektenmetalloprotease Inhibitor (IMPI) als AMP ausgewählt. Die pH-abhängige Resolubilisierung der IMPI-IBs war möglich und es wurde sowohl nach löslicher, als auch nach IB-basierter Produktion in E. coli bioaktiver IMPI isoliert.
Aktualisiert: 2020-01-27
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Die zunehmde Ausbreitung antibiotikaresistenter Erreger macht die Entwicklung neuer Wirkstoffklassen oder alternativer Strategien unabdingbar. Vielversprechende Kandidaten als neuartige Wirkstoffe sind dabei antimikrobielle Peptide (AMPs) aus Insekten, die so divers sind wie die Klasse der Insekten selbst und deren Vertreter unterschiedliche Wirkspektren gegen eine Vielzahl von Mikroben aufweisen. Um Insekten-AMPs für Forschung und Medizin nutzbar zu machen, müssen sie in großen Mengen rekombinant hergestellt werden. Viele AMPs sind jedoch toxisch gegenüber potenziellen Expressionswirten oder beinhalten Disulfidbrücken, was die Expression zu einer Herausforderung macht. Die optimale Kombination aus Expressionsstamm und -plasmid (Promotor, Fusionspartner) muss dabei für jedes AMP empirisch ermittelt werden.
In dieser Arbeit wurde daher ein Expressionsscreening in E. coli entwickelt, mit dem für jedes AMP systematisch nach den Parametern gesucht werden kann, mit denen eine maximal hohe lösliche Proteinausbeute erzielt wird. Variiert wurden dabei die Elemente, aus denen das Expressionsplasmid aufgebaut ist, wie Promotor und Fusionspartner, sowie der Bakterienstamm. Dazu wurde mithilfe der Golden Gate-Klonierung eine kombinatorische Plasmidbibliothek aufgebaut, innerhalb derer durch die einfache und parallelisierbare Klonierungstechnik eine freie Kombination von Plasmidelementen zu Expressionsplasmiden möglich ist. Für drei Modell-AMPs mit unterschiedlichen Charakteristika wurde die Effizienz der Klonierung untersucht und das Expressionsscreening durchgeführt.
Für Insekten-AMPs, die sich aufgrund ihrer Eigenschaften nicht in E. coli exprimieren lassen, wurde ein Protokoll zur Herstellung stabil exprimierender, monoklonaler Schneider 2-Insektenzelllinien etabliert.
Aktualisiert: 2020-12-08
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