Autor: Danny Atat

Hochspezifische Nukleasen sind potente genome editing tools mit deren Hilfe gezielt Doppelstrangbrüche verursacht werden können. Unter den verschiedenen Nukleasen erlaubt das CRISPR-Cas System eine vergleichsweise einfache und schnelle „Programmierung“. Damit die Endonuklease gezielt einen Doppelstrangbruch verursachen kann, muss das Enzym einen Komplex mit der guide RNA, einer 20 bp langen Nukleotidsequenz, bilden. Durch die Auswahl der guide RNA kann nahezu jeder Abschnitt der DNA adressiert werden. Ziel der Arbeit ist es herauszufinden, inwiefern die Informationen aus den Experimenten in zellfreien Reaktionssystemen Voraussagen über die Aktivität der Cas9 Endonuklease mit verschiedenen guide RNAs in der Zellkultur erlauben. Für die zellfreien Experimente musste guide RNA generiert und das Cas9 Protein exprimiert und aufgereinigt werden. Für die Versuche in der Zellkultur wurden zwei verschiedene guide RNA in den px330 Vektor kloniert, welcher zusätzlich auch das Gen für Cas9 enthielt. Dieser Vektor wurde zusammen mit einem Traffic light Reporter System (TLR) in eine HEK293 Zelllinie kotransfiziert. Das TLR System diente zur Erfassung der Aktivität und beinhaltet inaktive Fluoreszenzgene. Nach einem Doppelstrangbruch kam es durch Non homologous end joining (NHEJ) zu einem frameshift, wodurch das Fluoreszenzgen exprimiert wurde. Nach der Transfektion wurde mittels Westernblot die Expression von Cas9 in den Zellen nachgewiesen und mit Immunfluoreszenz-Aufnahmen die Translokation des Proteins in den Zellkern dargestellt. Die Aktivität wurde qualitativ mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und quantitativ mittels FACS Analysen überprüft. In den zellfreien Experimenten konnte erst bei einem 30-fachen Überschuss des Enzyms eine Nicking-Aktivität festgestellt werden, obwohl Doppelstrangbrüche des Vektorsubstrats erwartet wurden. Die Expression und Translokation des Cas9 Enzyms in den Zellkern konnte bewiesen werden. Insgesamt wurden Aktivitätstests für vier verschiedene targets (Cas9 T1- T4) durchgeführt. Einzig Cas9 T3 überragte mit 30 % Aktivität signifikant die anderen targets, welche keine Aktivität aufwiesen. Die Auswahl der geeigneten targets nimmt eine zentrale Rolle in der Versuchsplanung ein und beeinflusst das outcome entscheidend. Die Ergebnisse der zellfreien Versuche erlauben keine Rückschlüsse darauf, ob die gewählte guide RNA zusammen mit dem Cas9 Protein in den Zellkultur-Versuchen effizient sind.