Autor: Patricia Kasper

Ziel dieser Arbeit war es, TG-Sperma vom Bullen nachträglich in kleinere Portionen aufzuteilen und zu prüfen, ob diese in der In-vitro-Produktion (IVP) einsetzbar sind. Die nachträgliche Neuportionierung fand mittels zwei verschiedener Methoden statt. Bei den Sperm-Cuts wurden TG-Sperma-Straws, ohne dass das Sperma auftaut, in sechs ca. gleich große Stücke geschnitten. Bei der zweiten Methode, dem Refreezing, wurde das TG-Sperma aufgetaut, über einen Spermfilter aufbereitet und anschließend mit neuem Verdünner versetzt und wieder in flüssigem Stickstoff eingefroren. Hierbei entstanden aus einem Straw vier neue Portionen. Bei den Straw-Cuts wurden die Endstücke getrennt von den Mittelstücken betrachtet. Nach dem Auftauen sowie nach der Aufbereitung der Straw-Cuts und der Refreezing-Straws wurden die Spermaqualitätsparameter Konzentration, Motilität und der Anteil der lebenden Spermien mittels eines CASA-Systems ermittelt. Es wurde auch der DNA-Fragmentations-Index (DFI) bei den unterschiedlichen Spermagruppen (direkt nach dem Auftauen und nach dreistündiger Inkubation) mittels Flow-Zytometer ermittelt, um eine Aussage über die Intaktheit der Spermien-DNA treffen zu können. Zusätzlich wurde das Sperma auch in drei IVP-Durchgängen in der IVF eingesetzt. Nach der IVP wurden an Tag 7 und 8 die Teilungs- und Entwicklungsraten erfasst. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1. Die durchschnittliche Spermienkonzentration nach dem Auftauen lag bei den Straw-Cuts-Endstücken bei 38,5 ± 12,4 Mio/ml, bei den Straw-Cuts-Mittelstücken bei 34,5 ± 12 Mio/ml, bei dem Refreezing bei 4,1 ± 1,9 Mio/ml und bei der Kontrolle bei 40,7 ± 13 Mio/ml. Nach der Aufbereitung sank diese bei den Endstücken auf 3,7 ± 0,9 Mio/ml, bei den Mittelstücken auf 6,8 ± 2,8 Mio/ml, beim Refreezing auf 2,5 ± 0,5 Mio/ml und bei der Kontrolle auf 29,0 ± 10,2 Mio/ml. 2. Nach dem Auftauen betrug die Gesamtspermienmotilität bei den Endstücken 17,5 ± 3,9 %, bei den Mittelstücken 23,2 ± 3,6 %, beim Refreezing 7,1 ± 3 % und bei der Kontrolle 36,9 ± 1,6 %. Nach der Aufbereitung betrug diese bei den Endstücken 25,6 ± 3,8 %, bei den Mittelstücken 42,2 ± 10,5 %, beim Refreezing 8,2 ± 3,5 % und bei der Kontrolle 59,6 ± 2,2 %. 3. Der Anteil lebender Spermien nach dem Auftauen lag bei den Endstücken bei 21,3 ± 4,5 %, bei den Mittelstücken bei 25,8 ± 2,2 %, beim Refreezing bei 10,3 ± 8 % und bei der Kontrolle bei 41,3 ± 4,9 %. Nach der Aufbereitung stieg dieser Anteil bei den Endstücken auf 39,3 ± 6,4 %, bei den Mittelstücken auf 50,2 ± 12,1 %, beim Refreezing auf 15,1 ± 7,1 % und bei der Kontrolle auf 63,7 ± 4,5 %. 4. Der DFI zum Zeitpunkt 0 h betrug bei den Endstücken 4,3 ± 0,63 %, bei den Mittelstücken 4,0 ± 1,1 %, beim Refreezing 19,1 ± 5,2 % und bei der Kontrolle 3,05 ± 0,8%. Zum Zeitpunkt 3 h betrug dieser bei den Endstücken 9,8 ± 1,5 % bei den Mittelstücken 8,0 ± 2,1 %, beim Refreezing 25,5 ± 5,4 % und bei der Kontrolle 7,2 ± 0,6 %. 5. In der IVP stellte sich bei den Embryonen nach IVF mit Sperma aus den Endstücken eine Teilungsrate von 25,3 ± 8,3 % und eine Entwicklungsrate von 0 % dar. Bei den Embryonen mit Sperma aus den Mittelstücken zeigte sich eine Teilungsrate von 43,5 ± 11 % und eine Entwicklungsrate von 1,7 ± 1,2 %. Bei den Embryonen mit Sperma aus dem Refreezing betrug die Teilungsrate 25,6 ± 5,4 % und die Entwicklungsrate 0,8 ± 1,1 %. Die Embryonen mit Sperma aus der Kontrolle weisen eine Teilungsrate von 78,9 ± 1,5 % und eine Entwicklungsrate von 30,7 ± 6,7 % auf. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine Neuportionierung in kleinere Volumina von bereits gefrorenem Sperma untersucht und anschließend in der IVP verwendet. Aus den Ergebnissen der Gesamtspermienmotilität, dem Anteil lebender Spermien, dem DFI und den Teilungs- und Entwicklungsraten aus der IVP lässt sich schlussfolgern, dass sich beide Methoden nicht dazu eignen, für die IVP verwendet zu werden. Es können damit keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden. Das Herabsetzen der Spermienkonzentration vor dem zweiten Einfrierprozess wurde bewusst durchgeführt, jedoch ist diese Reduktion teilweise sehr stark. Möglicherweise können beide Methoden der angefertigten Arbeit optimiert werden, indem weniger Portionen aus dem gewonnenen Sperma hergestellt werden. Eine weitere Möglichkeit ist es, zu testen, ob die Spermien deutlich besser vor den Schäden durch die Kryokonservierung geschützt werden können.