Autor: Judith Esther Langenstein

Die Untersuchungen erfolgten im Rahmen des Sonderforschungsbereichs/ Transregio 79 (2010-2014): „Werkstoffe für die Geweberegeneration im systemisch erkrankten Knochen“ Teilprojekt T1: „Etablierung und Qualitätssicherung osteoporotischer Tiermodelle“. Die Versuche am Tier wurden in der Zentralen Forschungseinrichtung der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main durchgeführt. Der Tierversuchsantrag (GE: F31/36) wurde durch das Regierungs-präsidium Darmstadt am 27.09.2012 genehmigt. Serum und Urinproben, die für diese Arbeit relevant waren, wurden am Klinikum Veterinärmedizin, Klinische Pathophysiologie und Klinische Laboratoriumsdiagnostik der Justus-Liebig-Universität Gießen analysiert. Ziel dieses interdisziplinierten Forschungsprojektes war es, neue Knochenersatzmaterialien und Implantatwerkstoffe für den systemisch erkrankten Knochen des Menschen zu generieren. Für die dafür nötigen präklinischen Studien ist die Etablierung eines Tiermodells, welches die Prozesse am menschlichen Knochen in ähnlicher Weise widerspiegeln kann, unerlässlich. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion zwischen Knochen- und Energiestoffwechsel im Osteoporose-induzierten Schafmodell zu evaluieren, die beim Schaf bisher wenig bekannt ist. Der Untersuchungszeitraum erstreckte sich auf 8 Monate mit drei verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten (0, 3, 8 Monate). Hierzu wurden 31 adulte, gesunde weibliche Merino-Schafe in vier Gruppen mit vergleichbarem Alter eingeteilt. Der Altersmedian lag in den Gruppen um die 4,5 - 5,5 Jahre. Eine nicht - Sham operierte Gruppe (n = 8) diente als Kontrollgruppe. Die Osteoporoseinduktion erfolgte nach 3 Schemata: Die erste Gruppe sollte die postmenopausale Osteoporose der Frau imitieren. Dazu wurde die erste Gruppe (n = 7) ovarektomiert („OVX-Gruppe“). Die zweite Gruppe (n = 8) erhielt neben einer Ovarektomie eine Calcium/Vitamin D-defizitäre Diät („OVXD-Gruppe“) und stellte somit eine Form der sekundären Osteoporose dar. Die letzte Gruppe (n = 8) erhielt eine Kombination aus Ovarektomie, defizitärer Diät und Glukokortikoiden („OVXDC-Gruppe“, 320 mg/Schaf Methylprednisolon alle 14 Tage i.m.) und repräsentierte somit ebenfalls eine häufige sekundäre Osteoporoseform. Um einen Effekt auf den Knochenstoffwechsel zu beweisen, erfolgte in dieser Arbeit die Knochendichtebestimmung mittels Dual-Röntgen-Absorptiometrie (DXA) mit der Region of Interest „abdominal width“, in der die Veränderungen in den Lendenwirbelkörpern nachgewiesen werden konnten. Neben der Knochendichte (BMD) und dem Knochenmineralgehalt (BMC) wurden dabei das abdominale Fett und der Z-Score, d.h. die Abweichungen des BMDs in Standardabweichungen vom altersphysiologischen Mittelwert (hier die Werte aller Schafe zum Zeitpunkt 0) bestimmt. Ein Z-Score < -1 gilt nach Angaben in der Humanmedizin als pathologisch. Als Marker des Knochenstoffwechsels dienten die Elektrolyte Calcium, Magnesium und Phosphat sowie die fraktionierte Phosphatausscheidung (FEP) im Urin und die den Knochenstoffwechsel beeinflussenden Hormone Vitamin D (25-OH-Vitamin D), Parathormon (PTH) und Insulin-like growth Faktor 1 (IGF-1). Als Marker der Knochenformation wurden die knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP) und Osteocalcin (intaktes Osteocalcin) bestimmt. Die Marker der Knochenresorption umfassten N-terminales Telopeptid des Kollagen Typ I (NTX), Cathepsin K und Dickkopf-1 (DKK-1). Die Fructosamin-Serumkonzentration, der Fructosamin/Albumin -Quotient, unveresterte Fettsäuren (NEFAs) und die Insulin-Konzentration im Serum spiegelten den Energiestoffwechsel wider. Die Blutprobengewinnung erfolgte an der Vena jugularis Morgens im Stall der Zentralen Forschungseinrichtung. Zu diesem Zeitpunkt wurden auch eine DXA-Messung am narkotisierten Schaf und eine Uringewinnung mittels Katheterisierung der Schafe durchgeführt. Nach 8 Monaten (Endzeitpunkt) wurden die Schafe nach der letzten Probenentnahme im bereits narkotisierten Zustand mit 50 mg/ kg Pentobarbital-Natrium intravenös schmerzlos eingeschläfert. Die Elektrolyte Calcium und Magnesium wurden mittels isoelektrischer Elektrode am Analysegerät Nova CRT8 (Nova) bestimmt. Für die Messung der Phosphat-, Albumin- und Fructosaminkonzentration sowie der NEFAs fand das automatische Analysegerät Pentra 400 ABX Horiba) Einsatz. Die übrigen Analysen erfolgten mittels kommerziell erhältlicher Enzym-Immunoassays (EIA/ELISAs), wobei es sich um humane Testkits handelte, deren Kreuzreaktivität für das Schaf im Falle von Vitamin D, PTH, Cathepsin K, DKK-1 und IGF-1 nicht bekannt war. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die humanen Tests für PTH, Cathepsin K und DKK-1 aufgrund nicht ausreichender Kreuzreaktion beim Schaf nicht verwendet werden können. Die klinische Untersuchung zeigte bei den Schafen der OVXDC-Gruppe deutliche cushingoide Nebenwirkungen und 1/8 Schafen musste aufgrund einer pathologischen Trümmerfraktur 14 Tage vor Versuchsende euthanasiert werden. Die Induktion der Osteoporose führte zum Zeitpunkt 3 Monate zu einem signifikanten Absinken der Knochendichte (BMD) und des Knochenmineralgehalts (BMC) in der OVXDC-Gruppe. In der OVXD-Gruppe sanken die medianen Werte ebenfalls, jedoch war diese Veränderung nicht signifikant. Zu den Zeitpunkten 3 und 8 Monate zeigten die Schafe der OVXDC-Gruppe einen Z-Score von -3,3 bzw. -4,9 Standardabweichungen. In der OVX- und OVXD-Gruppe betrug der Z-Score zum Zeitpunkt 8 Monate -0,29 und -0,96 und war somit als altersphysiologisch zu interpretieren. Im zeitlichen Verlauf kam es in allen Gruppen zu einem signifikanten Anstieg des mittels DXA detektierbaren abdominalen Fettes. Dabei zeigte die OVXDC-Gruppe zum Zeitpunkt 8 Monate die höchsten Medianwerte, jedoch war dieser Unterschied nicht statistisch signifikant. Insgesamt zeigten sich die frühesten Veränderungen der Marker des Knochen- und Energiestoffwechsels zum Zeitpunkt 3 Monate in der OVXDC-Gruppe und erst später in der OVXD-Gruppe. Zum Zeitpunkt 3 Monate war in der OVXDC-Gruppe ein signifikantes Absinken der Serum-Calcium Konzentration nachweisbar. Die OVXD- Gruppe zeigte zu diesem Zeitpunkt eine signifikante Hyperphosphatämie. In beiden Gruppen war eine deutlich erhöhte FEP nachweisbar, jedoch war der Befund nur für die OVXDC-Gruppe signifikant. Die OVXDC-Gruppe zeigte zum Zeitpunkt 8 Monate eine signifikante Erhöhung der Osteocalcin-Serumkonzentration, die von einer signifikanten Erniedrigung der NTX-Konzentration begleitet war. Die Gabe einer defizitären Diät führte zum Zeitpunkt 3 Monate bei OVXDC-Gruppe und in geringerem Maße bei der OVXD-Gruppe zu einer signifikanten Erniedrigung der Vitamin D-Serumkonzentration. Bei der OVXDC-Gruppe blieb dies auch bis zum Zeitpunkt 8 Monate signifikant, wobei die Werte zu beiden Zeitpunkten nahe 0 lagen. In der OVXDC-Gruppe konnte zu den Zeitpunkten 3 und 8 Monaten eine signifikante Erhöhung des Fructosamin/Albumin-Quotienten festgestellt werden, der zum Zeitpunkt 3 Monate von einer signifikanten Hyperinsuliämie begleitet war. Die IGF-1-Serum-Konzentration veränderte sich nicht signifikant. Insgesamt lassen sich der niedrige BMD in der OVXDC-Gruppe in Zusammenhang mit den niedrigen NTX-Werten dieser Gruppe als Mineralisationstörung und Hinweis auf eine erniedrigte Osteoklastenzahl interpretieren. Letzteres muss durch histologische Untersuchungen bestätigt werden. Die Induktion einer sekundären Osteoporose - wie in diesem Modell durch Ovarektomie, Calcium/Vitamin D-defizitärer Diät und Glukokortikoiden - zeigt deutlichere Veränderungen im Vergleich zur primären Osteoporose, die alleine durch Ovarektomie dargestellt wurde. Insgesamt zeigte die OVXDC-Gruppe die deutlichsten Veränderungen im Knochenstoffwechsel, die sich auch in den Knochendichtemessungen widerspiegeln. Neben der deutlichen Hypocalcämie und der gesteigerten Phosphatauscheidung im Urin sowie der hochgradigen Hypovitaminose D konnten die Knochenformationsmarker Osteocalcin und BAP einen gestörten Knochenumsatz aufzeigen. Schlussfolgernd kann festgehalten werden, dass diese Studie durch die Kombinationsinduktion einer Osteoporose mittels Ovarektomie, defizitärer Diät (Calcium und Vitamin D) und Glukokortikoiden eine Basis für weitere Forschungen wie z.B. dem Einsatz neuartiger Biomaterialien zur Frakturversorgung am Tiermodell Schaf darstellt. In diesem Modell waren deutliche Veränderungen im Knochenstoffwechsel sowie eine Interaktion zwischen Knochen- und Energiestoffwechsel im Sinne einer transienten Insulinresistenz induzierbar, wobei jedoch die frühesten und ausgeprägtesten Veränderungen in der OVXDC-Gruppe auftraten, was darauf schließen lässt, dass Glukokortikoide beim Schaf einen schnelleren Effekt auf den Knochen- und Energiestoffwechsel haben als eine Ovarektomie und Diät alleine. Daher ist für präklinische Studien ein Kombinations-Schema inklusive Glukokortikoidgabe empfehlenswert, wobei jedoch die Menge an Methylprednisolon noch anzupassen ist, um starke Nebenwirkungen bei den Schafen zu vermeiden.