Autor: Carmen Rauschenbach

Störungen des Bewegungsapparates gehören bei Pferden zu den Hauptursachen für das Ausscheiden aus der sportlichen Nutzung. Die konventionellen Behandlungsoptionen verhindern nicht die Entstehung von minderwertigem Narbengewebe, wodurch es zu hohen Rezidivraten kommen kann. Ein neuer, vielversprechender Therapieansatz ist im Rahmen des Tissue Engineering (engl.: Gewebekonstruktion, TE) die Implantation von mesenchymalen Stammzellen/ multipotenten Stromazellen (MSC). Viele experimentelle und klinische Studien konnten zeigen, dass die Behandlung von Sehnenverletzungen mit MSC im Vergleich zur konventionellen Behandlung zu signifikant reduzierten Rezidivraten führte. Den Nährstoffanforderungen der MSC in-vitro wurde bisher wenig Aufmerksamkeit gewidmet. Ziel dieser Arbeit war es zu überprüfen welche Nährstoffanforderungen equine MSC in-vitro stellen und wie die tenogene, osteogene und adipogene Differenzierung die Nährstoffumsatzraten beeinflussen. Die verwendeten mesenchymalen Stammzellen wurden aus dem subkutanen Fettgewebe (ADSC) oberhalb des dorsalen gluteus medius eines drei jährigen Hengstes isoliert, in-vitro vermehrt und in unterschiedlichen Zelldichten kultiviert, sowie mit speziellen Differenzierungsmedien tenogen, adipogen und osteogen differenziert. Bei vielen der untersuchten Stoffwechselparameter zeigten die undifferenzierten ADSC in-vitro eine deutliche Abhängigkeit von der Dichte der Zellen auf den Kultivierungsplatten. So nahmen der Glucose- und Glutaminverbrauch sowie die Laktatproduktion mit zunehmender Zelldichte ab. Der Pyruvatverbrauch sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der LDH, PGK und PK nahmen hingegen mit zunehmender Zelldichte zu. Die ADSC bei niedriger Zelldichte (ADSC-ND) befanden sich in ihrer logarithmischen Wachstumsphase. Bei hoher Zelldichte (ADSC-HD) hatten die Zellen ihr Wachstumsplateau erreicht und teilten sich deutlich weniger. Im Vergleich zu den hoch teilungsaktiven ADSC-ND nahmen nach osteogener und tenogener Differenzierung der Glucose- und Glutaminverbrauch sowie die Laktatproduktion signifikant ab. Diese Abnahme in den Glycolyseumsätzen korrelierte mit der Abnahme der spezifischen Enzymaktivitäten der Aldolase und GAPDH. Die Abnahme der Glutaminolyse korrelierte in den tenogen und osteogen differenzierten Zellen mit einer Abnahme der mitochondrialen MDH zugunsten der cytosolischen MDH und in den tenogen differenzierten Zellen zusätzlich mit einer Abnahme der mitochondrialen AST zugunsten der cytosolischen AST. Im Vergleich zu den ADSC-HD gab es ausschließlich bei den Glutamatumsatzraten der osteogen differenzierten Zellen einen signifikanten Unterschied, da sie vom Glutamatverbrauch zur Glutamatproduktion wechselten. Die adipogen differenzierten Zellen hingegen blieben auf dem Niveau der Glycolyse-Umsatzraten der ADSC-ND. Bei den Umsatzraten der Glutaminolyse zeigten die adipogen differenzierten Zellen im Vergleich zu den ADSC-ND und ADSC-HD einen signifikant höheren Glutamatverbrauch und einen Wechsel zur Glutaminproduktion. Erstmalig konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass in den equinen ADSC niedriger und hoher Zelldichte die wenig aktive, an der Aminosäure Tyrosin 105 phosphorylierte, M2-PK vorkommt. Diese Form der M2-PK ist charakteristisch für Zellen mit einer hohen Teilungsrate. In Übereinstimmung dazu kam es in den tenogen, osteogen und adipogen differenzierten Zellen zu einer Abnahme der Menge an phosphorylierter M2-PK. Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, dass der Proliferationsmarker PCNA in den ADSC-HD im Vergleich zu den ADSC-ND nur leicht abnahm. Nach osteogener, tenogener und adipogener Differenzierung hingegen kam es zu einer starken Reduzierung der PCNA Expression. Aufgrund der Abnahme des Glutaminumsatzes in den osteogen und tenogen differenzierten ADSC stellte sich die Frage, wie sich eine Reduzierung der Glutaminkonzentration im Nährmedium auf die Proliferation und Differenzierung der Zellen auswirkt. In Bezug auf die Zellproliferation der undifferenzierten Zellen konnte im Glutaminmangel bei niedriger und mittlerer Zelldichte eine verminderte Teilungsrate im Vergleich zu den im glutaminreichen Medium kultivierten Zellen gezeigt werden. Bei hoher Zelldichte hingegen hatte der Glutaminmangel keinen Einfluss mehr auf die Teilungsrate der ADSC. Bei der tenogenen und osteogenen Differenzierung im Glutaminmangel, des in dieser Arbeit verwendeten Spenders, konnte die Zeitdauer bis zum Nachweis der Differenzierung deutlich verkürzt werden. Eine verkürzte osteogene Differenzierungszeit im Glutaminmangelmedium wurde im Anschluss an diese Arbeit bei drei von vier weiteren Spendern bestätigt. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung des Nährstoffangebotes auf die Proliferationskapazität und die Differenzierungsgeschwindigkeit von ADSC in-vitro. Bei der vergleichenden Bewertung der Stoffwechselergebnisse zwischen differenzierten und undifferenzierten Zellen ist eine mögliche Zelldichteabhängigkeit der zu untersuchenden Parameter zu berücksichtigen. Zukünftige Untersuchungen werden zeigen, ob die beobachteten morphologischen und metabolischen Effekte der Kultivierung der ADSC im Glutaminmangel zur Verkürzung der in-vitro Differenzierungszeit genutzt werden können, sowie den in-vivo Transplantationserfolg verbessern und als metabolische prä-Differenzierung Berücksichtigung bei der Implantation von Stammzellen im Rahmen des TE finden.