Autor: Sandra Natascha Ullsperger

Humane Immunzellen besitzen ein non-neuronales cholinerges System (NNCS), welches aus Acetylcholin (ACh) synthetisierenden Enzymen, Esterasen, Rezeptoren und Transportereinheiten für ACh besteht. Primärzellen und Zelllinien sind in der Lage ACh zu sekretieren, welches dann an muskarinische (MR) und nikotinische ACh Rezeptoren (nAChR) auf Immunzellen bindet. Die Immunzellen sind hauptsächlich für das Auffinden von Krankheitserregern und deren Bekämpfung zuständig. Diese können durch Zytokin-Ausschüttung, Lipopolisaccharide (LPS) oder Tumornekrose-faktoren (TNF) verheerende Krankheiten, wie z. B. eine Sepsis auslösen. Durch eine Inflammation im Blut reagieren die humanen Immunzellen und die Komponenten des NNCS, verändern ihre Genexpression und setzen vermehrt ACh frei. Um herauszufinden, welche Komponenten des NNCS sich während einer induzierten Inflammation durch LPS-Stimulation verändern und welche Immunzellen in der Lage sind ACh zu sekretieren, und das im Vergleich zu unbehandelten Immunzellen, wurden verschiedene Primärzellen (CD4+-, CD8+-, CD14+-, CD19+- und CD25+-Zellen) von gesunden Probanden und Zelllinien (THP-1, MM6 und Jurkat) daraufhin analysiert. Durch unterschiedliche Analysetechniken, wie Endpunkt-PCR und RT-qPCR, Western Blot und HPLC konnten die meisten Komponenten des NNCS und die ACh-Freisetzung im Medium der kultivierten Immunzellen durch ACh-Messung nachgewiesen werden. Des Weiteren analysierten wir die verschiedenen Ausgangs-materialien der Blutentnahme aus Buffy Coats (BC) und frisch isolierten Vollblutproben (fV), da in Vorversuchen der Immunzellen Veränderungen der Genexpression der cholinergen Komponenten festgestellt wurden. Ferner sollte ein Vergleich zwischen dem Modell Zelllinien und Primärzellen Aufschluss geben, ob und in wie weit diese miteinander kompatibel sind. Die mRNA-Expressionsanalysen des NNCS zeigen für Primärzellen und Zelllinien, dass sie beide Rezeptortypen (m- und nAChR) exprimieren. Es konnten alle mAChR Subtypen M1R-M5R detektiert werden, wobei eine vermehrte Expression der mAChR M3R, M4R und M5R nachgewiesen werden konnte. Bei den nAChR UE konnten wir in den Zelllinien im Vergleich zu den CD4+- und CD14+-Primärzellen eine fast identische Verteilung der nAChR feststellen. Daher wurden hauptsächlich α5, α6, FAM7A und α10 nachgewiesen, jedoch konnten wir von den nAChR β-UE 2-4 kaum einen Nachweis erbringen. Die vorherrschenden Transportereinheiten waren die organischen Kation-transporter (OCTs), hauptsächlich OCT1 konnte in allen getesteten Immunzellen nach-gewiesen werden. Die vermehrte Expression der OCTs in Immunzellen, kann ein Hinweis auf eine schnelle Immunantwort sein, da die Signalweitergebung über die Diffusion der OCTs verläuft. Obwohl wir als weitere Transporteinheiten den hoch-affinen Cholintransporter (ChT1) und auch den vesikulären ACh-Transporter (vAChT) sowohl in den Zelllinien als auch den Primärzellen detektierten. Die Synthese von ACh wurde vermehrt über die Carnitinacetyltransferase (CarAT) in allen getesteten Immunzellen über mRNA-Expression nachgewiesen. Die Genex-pression von peripherem (p) und common (c) Acetylcholintransferase (ChAT) konnte nur in den Zelllinien detektiert werden. Genauso schwierig erwies sich der Nachweis der Esterasen. Sowohl die Acetlylcholin- (AChE) als auch die Butyrylcholinesterase (BChE) konnten hauptsächlich in den Zelllinien detektiert werden, während in den CD4+- und CD14+-Primärzellen nur AChE exprimiert wurde. Durch eine induzierte Inflammation über LPS-Stimulation konnten wir in manchen Genen eine „on-off“-Genexpression nachweisen, so dass im stimulierten Zustand das Gen ausgeschaltet, hoch- oder runterreguliert war. Bei den PCR-Analysen sind in den Primärzellen viele inter-individuelle Differenzen nachgewiesen worden. Dies spricht für eine angepasste Immunität auf Umweltfaktoren oder Erkrankungen. Die Western Blots erfolgten für die Antikörper (AK) anti-ChAT, -vAChT und –ChT1 in Primärzellen als auch in den Zelllinien. Dabei wurden bei den CD4+- und CD14+-Primärzellen viele, wahrscheinlich unspezifische Banden, für vAChT detektiert. Das ChAT-Protein konnte nur in den CD4+-T-Zellen und ChT1 in CD4+- und CD14+-Primärzellen als auch in den Zelllinien nachgewiesen werden. Die getesteten Immunzellen sind fähig ACh zu sekretieren. Dabei wurden Unterschiede zwischen den Primärzellen und den Zelllinien festgestellt. Die monozytären Zelllinien THP-1 und MM6 sekretierten auch bei einer LPS-Stimulation kaum ACh, während die Jurkat T-Zelllinie eine hohe ACh-Menge von fast 30 nM aufwies, im Gegenzug zu den CD4+-T-Zellen, die kein ACh sekretierten und den CD14+-Monozyten, die bis zu 1,5 nM ACh frei setzten.