Autor: Kristina Weiler

Ziel der Studie Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Methodenvalidierung der Messung der retikulierten Thrombozyten als Marker der thrombozytären Regeneration am ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Inc., USA) aus Vollblutproben des Hundes im direkten Vergleich zur durchflusszytometrischen Analyse als Referenzmethode. Ein weiteres Ziel war die Überprüfung der Präzision sowie die Erstellung eines Referenzintervalles für diesen neuen Parameter. Material und Methoden Für den Methodenvergleich wurden in einem Zeitraum von März 2017 bis November 2017 prospektiv EDTA-Vollblutproben von 56 Hunden analysiert. Dabei wurden sowohl gesunde Hunde, als auch Patienten mit Thrombozytopenie gemessen, bei denen hohe Werte der retikulierten Thrombozyten zu erwarten waren. Ausschlusskriterien waren einerseits das Vorliegen von Thrombozytenaggregaten Grad 2-4 (von 0-4) nach semiquantitativer Beurteilung des Blutausstriches sowie fehlerhafte oder nicht auswertbare Analysen am Durchflusszytometer. Letzere traten z. B. bei Verschmutzung des Waschpuffers, unspezifischer Bindung der Antikörper oder bei Vorliegen von markierten Events, die außerhalb der für Thrombozyten spezifischen Position im Scattergramm lagen, auf. Somit konnten 42 von 56 Messungen für den Methodenvergleich eingeschlossen werden. Die Bestimmung der prozentualen Werte der retikulierten Thrombozyten erfolgte durch Setzen eines Gates im optischen Messkanal der Thrombozyten, mit der geräteeigenen Software des ProCyte Dxs. Im Anschluss erfolgte eine Messung am Durchflusszytometer unter Verwendung von CD61-Antikörpern, mit denen eine Markierung der Thrombozyten ermöglicht wurde und gleichzeitiger Darstellung des RNA-Gehalts durch den Einsatz von Thiazolorange. Bei beiden Geräten wurde die Präzision unter Berechnung des intra-assay Variationskoeffzienten aus einer zehnfachen Wiederholungsmessung ermittelt. Die statistische Auswertung des Methodenvergleiches erfolgte durch Berechnung des Spearman-Korrelationskoeffizienten, einer Bland-Altman-Analyse sowie einer Passing-Bablok-Regressionsanalyse. Dabei kamen das Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) und die statistische Software MedCalc® Version 17.8.6 (MedCalc Software Ltd, Ostende, Belgien) zum Einsatz. Für die Erstellung eines Referenzintervalls konnten Messungen von 120 gesunden adulten Hunden (Alter zwischen 1 Jahr und 14 Jahren) eingeschlossen werden. Die Berechnung erfolgte mit Hilfe des Reference Value Advisor Version 2.1 (Biostatistiques, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Frankreich). Hier kam die nichtparametrische Methode zum Einsatz. Ergebnisse Der Spearman-Korrelationskoeffizient (rs) zeigte mit einem Wert von 0,70 eine moderate Korrelation der beiden Messmethoden an. Dabei fiel in der Bland-Altman-Analyse ein mittlerer negativer proportionaler Bias von -8,2 % des ProCyte Dx im Vergleich zur Durchflusszytometrie auf. Hinsichtlich der Präzision lag der intra-assay Variationskoeffizient in einer Probe mit vergleichsweise niedrigen Werten der retikulierten Thrombozyten (Mittelwert 2,8 %) bei 32,89 % für den ProCyte Dx und bei 12,85 % für die durchflusszytometrische Analyse. Bei Analyse eines Patienten mit Thrombozytopenie und hohen Werten der retikulierten Thrombozyten (Mittelwert 31,6 %) hingegen zeigte der ProCyte Dx einen deutlich niedrigeren Variationskoeffizienten von lediglich 7,52 %. Das 95%-Referenzintervall der Messung retikulierter Thrombozyten am ProCyte Dx lag bei 0-7,47 %. Schlussfolgerung Der ProCyte Dx ist in der Lage die retikulierten Thrombozyten des Hundes zu bestimmen. Im Vergleich zum Durchflusszytometer zeigt sich eine akzeptable, allerdings keine herausragende Korrelation sowie das Vorliegen eines Bias, was anhand der unterschiedlichen Methodik der Messgeräte allerdings nicht überrascht. Zudem konnten hier lediglich 42 Vergleichsmessungen durchgeführt werden, was als Limitation der Studie zu sehen ist, da eine breitere Verteilungsspanne der Messergebnisse wünschenswert gewesen wäre. Mit Hilfe der neu erstellten Referenzintervalle können erhöhte Werte bei Patienten mit Thrombozytopenie detektiert werden, welche ein Hinweis auf eine aktive Megakaryopoese sind und somit von klinischer Relevanz sind. Die klinische Überprüfung des Parameters am ProCyte Dx bei Patienten mit Thrombozytopenie könnte Gegenstand zukünftiger Studien sein. Die Etablierung der Messung durch den ProCyte Dx als Point-of-care Analyzer bietet den Vorteil, dass der Parameter in Zukunft auch für kleinere Praxen zugänglich sein könnte. Bei gesunden Patienten mit niedrigen Werten der retikulierten Thrombozyten ist jedoch eine gewisse Messungenauigkeit in Kauf zu nehmen, wohingegen die Wiederholbarkeit bei erhöhten Werten und somit klinisch relevanten Bereichen zufriedenstellende Ergebnisse erzielt.