Morphologische Untersuchung AAV-transduzierter Retinae nach subretinaler Injektion in Ratten
Bert Constantin Giers
Ziel: Beurteilung der Effekte der subretinalen Injektion, des AAV-vermittelten Gentransfers und der GFP-Expression in Photorezeptoren auf die Morphologie der Retina und den Apoptose-Status retinaler Zellen in Ratten, denen entweder eine Fluoreszein-Lösung oder ein AAV2/5-Vektor mit dem GFP-Gen unter einem CMV-Promoter subretinal injiziert wurde.
Methoden: Untersuchung der Morphologie der äußeren Körnerschicht mittels immuncytochemischer Markierung zellulärer Zielstrukturen und konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie sowie Transmissionselektronenmikroskopie; Quantifikation der Synapsen in der OPL; Beurteilung des Gliose-Status; TUNEL-Assay.
Ergebnisse: Trotz der hohen Plastizität synaptischer Strukturen vor allem in der äußeren plexiformen Schicht, die auf verschiedentlich verursachte Degenerationen und Verletzungen mit typischen Reaktionsmustern, wie Verkürzung und Rückzug der Stäbchen-Endknöpfchen, Aussprossungen dendritischer Fortsätze von Horizontal- und Bipolarzellen sowie Bildung ektoper Synapsen reagieren, konnten in dieser Studie keine histologischen Veränderungen festgestellt werden. Sowohl bei Fluoreszein-injizierten als auch bei GFP-transduzierten Retinae zeigte sich die äußere plexiforme Schicht strukturell normal organisiert und es fanden sich keine Anzeichen für eine Verkürzung und einen Rückzug der Stäbchen-Terminalien. Horizontal- und Stäbchen-Bipolarzellen wiesen keinen Verlust dendritischer Endigungen auf und insbesondere zeigten sich keine Aussprossungen von Zellfortsätzen in die äußere Körnerschicht. Auch auf ultrastruktureller Ebene zeigten sich Zapfen-Füßchen und Stäbchen-Terminalien unverändert. Die Anzahl synaptischer Kontakte zwischen Stäbchen und Stäbchen-Bipolarzellen war nicht reduziert. Obwohl die durch die subretinale Injektion verursachte vorübergehende Netzhautablösung zu einer verstärkten GFAP-Expression in den Müller-Zellen führt, fanden sich keine Anzeichen für eine schwerere Gliose. In behandelten Netzhäuten tritt kein vermehrter Zelltod durch Apoptose auf.
Schlussfolgerungen: Der AAV-vermittelte Gentransfer und die Expression des GFP-Transgens in den Photorezeptoren führen weder zu morphologischen Veränderungen der Netzhaut noch zu einer erhöhten Apoptoserate. Es handelt sich somit um einen sicheren und effizienten Weg zur Einbringung eines Transgens in Zellen der äußeren Retina.
