Schlüsselwort: BoDV-1

Charakteristik der intranasalen Infektion mit neurotropen Bornaviren unter Berücksichtigung antiviraler Interventionsstrategien Sabrina Munsch 1. Ein Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Wirkung eines Furininhibitors (MI 0701) auf die intranasale Infektion mit dem Borna disease virus 1 der Ratte, einem seit langem etablierten Tiermodell zur Untersuchung neurotroper Virusinfektionen. Daten zur Inhibition der Spaltung des viralen Glykoproteins durch den Furininhibitor und die Auswirkung auf die Infektion des olfaktorischen Systems lagen bislang nicht vor. Der peptidomimetische Inhibitor MI-0701 gehört zu den wirksamsten, reversibel bindenden, niedermolekularen Furininhibitoren, dessen Wirksamkeit an diversen Beispielen viraler sowie bakterieller Infektionen gezeigt werden konnte. In-vivo-Untersuchungen mit dem Inhibitor an BoDV-1-infizierten Tieren wurden ebenfalls bislang nicht durchgeführt. Die eigenen Untersuchungen sollten zum Verständnis der initialen Phasen intranasaler Infektionen mit neurotropen Viren und möglicher antiviraler Therapieansätze bislang unzulänglich behandelbarer neurotroper Virusinfektionen beitragen. Ein weiteres Ziel war die Charakterisierung der initialen Vermehrung des BoDV 1 im olfaktorischen System sowie der entsprechenden infizierten Zellen. Dabei sollte besonderes Augenmerk auf den die olfaktorischen Nervenfasern umhüllenden olfactory ensheathing cells (OEC) liegen, vorherige Untersuchungen ließen eine zentrale Bedeutung bei der Pathogenese der Bornaschen Krankheit vermuten. Die speziellen Mechanismen der intranasalen Virusverbreitung sind bislang nur unzulänglich verstanden. Virale Infektionen können weiterhin z. B. durch Regulation des Zelltods die Homöostase des olfaktorischen Epithels beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher auch untersucht werden, ob auch die intranasale BoDV-1-Infektion einen Einfluss auf den Zelltod des olfaktorischen Epithels hat. 2. Um den Einfluss des Furininhibitors auf die Infektionsrate in-vitro zu untersuchen, wurde eine Dissoziationskultur des olfaktorischen Epithels (OE) der Ratte mit BoDV-1 infiziert und mit dem Inhibitor behandelt. Nach 4, 7 und 10 dpi lag der Anteil infizierter Zellen bei den unbehandelten Kontrollkulturen stets höher als bei denen nach Inhibitorzugabe (p<0,0001). Es konnte eine dosisabhängige Reduktion der Infektionsrate mit einer maximalen Reduktion um knapp 80 % nach Behandlung mit 10 µM des Furininhibitors nach 10 dpi festgestellt werden. Zudem sollte untersucht werden, ob die Inhibitorzugabe nach BoDV-1-Infektion einen Einfluss auf den Neuronenanteil in der Kultur hatte. Es konnte gezeigt werden, dass der Neuronenanteil abhängig von der Behandlung war (p=0,0001). Während die BoDV-1-infizierten Kulturen stets den niedrigsten neuronalen Anteil aufwiesen (10 dpi: 4,4 %), zeigten die zusätzlich mit 10 µM MI-0701 behandelten Kulturen den höchsten Neuronenanteil auf (10 dpi: 9,9 %). Dies kann für einen potentiell protektiven Effekt des Inhibitors MI-0701 bei viraler Infektion auf die olfaktorischen Neurone sprechen. Bei molekularbiologischen Untersuchungen zum Nachweis viraler messenger RNA (mRNA) und genomischer RNA (gRNA) des infizierten OEs mittels quantitativer real time RT-PCR zeigte sich initial nach 4 dpi eine äquivalente virale Replikation und Transkription, während nach 7 dpi das Verhältnis zugunsten der Transkription verschoben war und somit die virale Proteinneubildung begünstigt wurde. Olfaktorische Hüllzellen (OEC) zeigten in vorherigen Untersuchungen eine zentrale Bedeutung bei der intranasalen Infektion mit BoDV-1. Permanente OECs der Ratte wurden hier erstmalig erfolgreich mit BoDV-1 infiziert und es wurde eine stetige Virusausbreitung über die Zeit bis hin zu einer Infektionsrate von 16,8 % nach 6 dpi festgestellt (p=<0,0001). Nach Inhibitoranwendung konnte eine dosisabhängige Reduktion der Infektionsrate (p=0,0027) mit einer maximalen Reduktion um mehr als 85 % nach Behandlung mit 10 µM des Inhibitors nach 6 dpi festgestellt werden. Bei molekularbiologischen Untersuchungen der infizierten OECs mittels quantitativer RT-PCR zum Nachweis viraler mRNA und gRNA zeigte sich initial nach 4 dpi eine verhältnismäßig höhere virale Replikationsrate im Vergleich zur Transkription, während sich die Werte nach 7 dpi denen für die Transkription anglichen. Dies unterstreicht die Rolle der olfaktorischen Hüllzellen während der BoDV-1-Infektion und die Hypothese, dass sie in der initialen Infektionsphase die virale Replikation fördern. Insgesamt weisen die Ergebnisse der in-vitro-Untersuchungen auf eine signifikante Inhibition der Infektionsausbreitung im olfaktorischen System durch den Einsatz von MI-0701 hin. Insbesondere die olfaktorischen Hüllzellen scheinen für die Infektion besonders empfänglich zu sein und können so auch ein vielversprechendes Ziel bei der Reduktion der Infektionsrate sein. 3. Zum Studium des Inhibitoreinflusses in-vivo wurden Lewis-Ratten intranasal mit BoDV-1 infiziert und anschließend 0,5 mg MI-0701/kg Körpergewicht appliziert. Zu keinem Untersuchungszeitpunkt konnten Anzeichen einer Erkrankung bei den Tieren festgestellt werden. Nach 21 dpi zeigten die Tiere sowie auch diejenigen der Kontrollgruppe eine geringgradige nicht-eitrige Meningoenzephalitis. Abhängig von der anatomischen Lokalisation war mittels immunhistologischer Untersuchung eine Reduktion des Nachweises von BoDV-1-N um bis zu 68 % der infizierten Zellen im olfaktorischen Epithel festzustellen. Auf zellulärer Ebene konnte die deutlichste Reduktion der Infektion bei den olfaktorischen Hüllzellen (65 %) und den olfaktorischen Nervenfasern (67 %) detektiert werden, was wiederum die in-vitro Daten bestätigt. Nervalen Strukturen kommt also wie erwartet nicht nur bei der initialen Infektion und der Virusausbreitung, sondern auch bei deren Hemmung eine besondere Bedeutung zu. Mittels quantitativer real time RT-PCR zum Nachweis viraler mRNA und gRNA zeigte sich nach 21 dpi eine Reduktion der Replikation in der Nase um bis zu 45 %, die Transkription zeigte jedoch keine Reduktion. Abhängig von der zerebralen Struktur war mittels immunhistologischer Untersuchung zum Nachweis von BoDV-1-N auch im Gehirn eine Reduktion des Infektionsscores um bis zu 58 % festzustellen. Mittels quantitativer real time RT-PCR zum Nachweis viraler mRNA und gRNA zeigte sich nach 21 dpi eine Reduktion der viralen Replikation in untersuchten Gehirnregionen um bis zu 63 %, die virale Transkription zeigte im Gehirn fast keine Reduktion. Mittels quantitativer real time RT-PCR zeigte sich im Gehirn bei den infizierten Tieren ein zeitabhängiger Anstieg für die virale Replikation sowie für die Transkription, wobei stets ein Verhältnis zugunsten der Transkription nachweisbar war. Absolut waren in rostral gelegenen Arealen die höchsten Werte zu bestimmen, was dem bekannten Verlauf der BoDV-1-Infektion entspricht. Insgesamt sprechen die Ergebnisse der in-vivo-Untersuchungen dafür, dass der intranasale Einsatz von MI-0701 zu einer Reduktion der Infektion in der Nase sowie im Gehirn führte. Inwieweit die Wirkung des Furininhibitors auf die virale Replikation eine Folge der reduzierten Virusweitergabe an nicht-infizierte Zellen aufgrund des Fehlen eines biologisch aktiven, viralen Glykoproteins ist oder der Inhibitor MI-701 auch direkt in die Phasen der viralen Replikation eingreifen kann, muss in weiteren Studien geklärt werden. 4. Um den Einfluss der BoDV-1-Infektion auf den Zelltod im olfaktorischen Epithel zu erforschen, wurde Gewebe intranasal infizierter Ratten immunhistologisch qualitativ und quantitativ auf das Vorkommen von Caspase3 (stellvertretend für lokale Apoptose) und AIF (stellvertretend für lokalen Parthanatos) untersucht. Dabei wurde zu keinem Untersuchungszeitpunkt ein signifikanter Unterschied für die Caspase-positiven Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe gefunden, AIF war überhaupt nicht detektierbar. Insgesamt sprechen die Ergebnisse dafür, dass bei viraler Infektion eine Modifikation der Homöostase des olfaktorischen Epithels mittels Apoptose nicht stattfindet, Parthanatos scheint auch unabhängig von einer Infektion keine Rolle beim Zelltod dieses Epithels zu spielen. 5. In der vorliegenden Arbeit wurde zusammenfassend gezeigt, dass die Proproteinkonvertase Furin eine entscheidende Rolle bei der Virusinfektion spielt und die Anwendung des Furininhibitors MI 0701 sowohl in-vitro als auch in-vivo zu einer signifikanten Reduktion der zellulären Infektionsrate im Vergleich zu den Kontrollgruppen geführt hat. Ein zusätzlicher, noch weiter zu klassifizierender, neuroprotektiver Charakter oder mögliche direkte Interaktionen mit der viralen Replikation erscheinen nicht ausgeschlossen. Eine besondere Rolle in Bezug auf Effizienz kommt bei der Inhibition der viralen Infektion den olfaktorischen Hüllzellen zu. Der Inhibitor stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Reduktion der Viruslast als Therapeutikum oder zur Metaphylaxe bei Infektionen mit Bornaviren dar. Somit liefert diese Studie wichtige Erkenntnisse zur Übertragung neurotroper Virusinfektionen mit zoonotischem Potential.