Schlüsselwort: CAS9

Das therapeutische Genome Editing ist eine Methode, um krankheitsverursachende Mutationen direkt am Genom der Betroffenen zu therapieren. Sie findet Anwendung u.a. in der Ophthalmologie zur Erforschung und Erarbeitung von Therapiestrategien für erbliche Netzhauterkrankungen. Das Prinzip des Genome Editing beruht auf der Verwendung von Designer-Endonukleasen, wobei das derzeit bedeutendste Werkzeug das CRISPR/Cas9-System darstellt. Dieses ermöglicht zielgenau Doppelstrangbrüche im Genom zu erzeugen, welche im Anschluss durch zelleigene Reparaturmechanismen, wie das NHEJ, MMEJ und HDR, verschlossen werden. Dabei wird das fehleranfällige NHEJ primär zu Gen-Veränderungen durch Gen-Knockout verwendet. Homologie basierte Reparaturmechanismen wie MMEJ und HDR hingegen finden Anwendung in der Genkorrektur und -ersatz und sind in der Lage, in Anwesenheit eines Reparaturtemplates dieses in das Genom zu integrieren. Die Herausforderung ist es, diese Techniken so effizient und nebenwirkungsfrei wie möglich zu gestalten, damit sie im klinischen Alltag eingesetzt werden können. Ziel dieser Arbeit war es, eine Herabregulierung des fehleranfälligen NHEJ-Reparaturweges durch den Knockout eines seiner Schlüsselenzyme zu erreichen. Dies sollte zu einer Effizienzsteigerung der konkurrierenden Reparaturmechanismen und damit zu der Verbesserung Homologie-basierter Genome Editing Strategien beitragen. Hierzu wurde die Expression des NHEJ-Schlüsselenzyms Ku70 durch einen CRISPR/Cas9 vermittelten Gen-Knockout in murinen Zelllinien inhibiert. Das Ku70 Protein ist eine Untereinheit des Ku-Heterodimers, welches mit hoher Affinität freie Doppelstrangenden bindet und in der Einleitung des NHEJ-Reparaturweges beteiligt ist. Die Abnahme der Ku70-Expression in den Knockout Zellen wurde zunächst mittels Western-Blot nachgewiesen. Hierbei konnte eine Herabregulierung des Ku70-Proteins auf 28,3 % der Ausgangsmenge erzielt werden. Der Einfluss auf die NHEJ-Aktivität wurde daraufhin mittels BRET-basierter Methodik untersucht, wobei eine reproduzierbare Abnahme der NHEJ-Events erzielt werden konnte. Die Auswirkung auf die MMEJ-Aktivität wurde mittels Luziferase-Assay beurteilt. Dabei konnte eine Abnahme der Einbaueffizienz der zugefügten Templates nach Herabregulation des NHEJ festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf einen bedeutenden Einfluss eines Ku70 Knockouts auf die NHEJ-Aktivität hin. In Zukunft sollten die Funktionsweisen weiterer in den Reparaturwegen involvierter Proteine untersucht werden, um ein vollständiges Verständnis über die Wechselwirkungen zu erlangen und eine Optimierung von Genome Editing Strategien zu bewirken.