Schlüsselwort: Signalpeptid

Die Erkennung Pathogen-assoziierter Moleküle durch das angeborene Immunsystem ist ein wesentlicher Bestandteil für eine effiziente Immunantwort zur Eliminierung von Pathogenen. Die Erkennung von bakterieller RNA und ihre immunstimulatorischen Eigenschaften sind in den letzten Jahren in den Fokus aktueller Forschung gerückt. Bakterielle RNA stimulieren die Produktion inflammatorischer Zytokine und induzieren eine starke Typ-I Interferon-Antwort. Der fakultativ intrazelluläre Lebensmittelkeim Listeria monocytogenes (Lm) stimuliert eine hohe Typ-I IFN-Antwort, die sein intrazelluläres Wachstum unterstützt. Für die Stimulation einer Typ-I IFN-Antwort sind lebende intrazelluläre Lm eine Vorraussetzung. Die sekretierte RNA aus Lm wurde als potentieller Auslöser einer IFN-β-Induktion beschrieben und Sequenzierungsdaten dieser RNA-Fraktion identifizierten die Anreicherung kleiner nicht-kodierender RNAs (sRNA). Einige dieser sRNAs haben individuell das Potential zur Stimulation einer IFN-β-Expression. Über den Sekretionsmechanismus solcher RNAs ist wenig bekannt. SecA2 ist ein zusätzliches Motorprotein des generellen Sec-Sekretionssystems in einigen Gram-positiven Bakterien und steht mit der Virulenz einiger Pathogene im Zusammenhang. Neben einer kleinen Auswahl an SecA2-abhängigen Proteinen, wurde eine SecA2-abhängige Sekretion von RNAs vermutet. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in definiertem Nährmedium gewachsene Lm-ΔsecA2 reduzierte Mengen an frei sekretierter RNA im Überstand (hier als sec-RNA bezeichnet) aufweist, welche strikt von der Membranvesikel (MVs)-Fraktion getrennt wurden. Die sec-RNA von Lm-ΔsecA2 zeigt ein schwächeres Potential zur IFN-β-Induktion als Lm auf. Eine mögliche Beteiligung der SecA2-abhängigen Enolase (Eno) an diesen Effekt wurde durch die Deletion der RNA-bindenden Eno gezeigt, die einen beeinträchtigenden Effekt auf die Sekretion individueller, potentielle IFN-β-induzierende sRNAs hat. In dieser Arbeit isoliertes, rekombinantes SecA2 wurde in Assoziation mit kurzen RNAs gefunden, die das Potential zur IFN-β-Induktion haben. SecA1, das in Lm für die Sekretion einer Vielzahl an Proteinen benötigt wird, ist dagegen mit RNAs hoher Diversität assoziiert und diese haben eine geringere Kapazität zur IFN-β-Expression in Makrophagen Diese Ergebnisse geben Grund zur Annahme, dass SecA2-assoziierte RNA eine Teilmenge der sec-RNA sind. RNA-Sequenzierungsdaten der SecA2-assoziierten RNA identifizierten die Anreicherung einiger sRNA, welche kürzlich als potentielle Auslöser einer IFN-β-Induktion identifiziert wurden. Unter diesen sRNAs wurde die kleine nicht-kodierende sRNA rli32 angereichert vorgefunden. Rli32 ist eine der potentiellsten IFN-β induzierenden sRNAs und ein Teil der sekretierten RNA. Rli32 wird intrazellulär höher exprimiert, ist hoch konserviert in Lm und zeigt eine RIG-I (retinoic acid inducible gene I)-abhängige Stimulation der IFN-β-Antwort. Für die Erkennung von rli32 über den cytosolischen Rezeptor RIG-I ist ein bestimmtes Motiv (Motiv2) der rli32-Sequenz essentiell, was in dieser Arbeit durch Mutationen in Motiv2 gezeigt wurde. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von rli32 zu einer stark erhöhten IFN-β-Induktion in Makrophagen führt und dieser Effekt das intrazelluläre Wachstum von Lm verbessert. Die Deletion von rli32 führt dagegen in ein limitiertes intrazelläres Wachstum. Der wachstumsfördernde Effekt von rli32 auf intrazelluläre Lm kann durch den Januskinasen (JAK)-Inhibitor Ruxolitinib (Rux) aufgehoben werden. Außerdem wurde hier nachgewiesen, dass die Überexpression von rli32 die Resistenz von Lm gegenüber Wasserstoffperoxid (H2O2) begünstigt und Lm anfälliger gegenüber dem Cephalosporin Cefuroxim macht. Letzteres steht in Bezug zu den in dieser Arbeit beobachteten Veränderungen der Zellhülle von Lm. Eine vergleichende RNA-Sequenzierung identifizierte eine Regulation der sRNAs LhrC1-4 durch rli32, welche bei Eisentoxizität und Zellwand-Stress induziert werden. Die vergleichenden Proteomdaten dieser Arbeit zeigten veränderte Proteinkompositionen in der Zellhülle von Lm durch veränderte rli32-Expressionslevel auf und hypothetisieren eine bakterielle physiologische Funktion von rli32 im Stickstoff-Metabolismus. Darüber hinaus zeigte die Überexpresssion von rli32 eine erhöhte Sekretion von Eno, was indirekt auf eine erhöhte Aktivität des SecA2-abhängigen Sekretionsweges hinweist. Zu dem liegt SecA2 in räumlicher Nähe zu RNA-Protein-Komplexen wie den aktiv translatierenden Ribosomen, deren Assoziation mit SecA2 in dieser Arbeit beobachtet wurde. Die hier vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse in der Sekretion von Typ-I IFN-induzierenden sRNAs durch SecA2 und deckt erste Hinweise auf eine Mitbeteiligung der SecA2-abhängigen Enolase auf. Darüber hinaus zeigen die hier vorgestellten Ergebnisse zur sRNA rli32 zum ersten Mal einen Zusammnehang zwischen den Typ-I IFN-stimulierenden Fähigkeiten individueller, sekretierter sRNAs und der intrazellulären Physiologie von Lm.