Entwicklung eines Expressionsscreenings zur Herstellung antimikrobieller Peptide
Christine Schreiber
Die zunehmde Ausbreitung antibiotikaresistenter Erreger macht die Entwicklung neuer Wirkstoffklassen oder alternativer Strategien unabdingbar. Vielversprechende Kandidaten als neuartige Wirkstoffe sind dabei antimikrobielle Peptide (AMPs) aus Insekten, die so divers sind wie die Klasse der Insekten selbst und deren Vertreter unterschiedliche Wirkspektren gegen eine Vielzahl von Mikroben aufweisen. Um Insekten-AMPs für Forschung und Medizin nutzbar zu machen, müssen sie in großen Mengen rekombinant hergestellt werden. Viele AMPs sind jedoch toxisch gegenüber potenziellen Expressionswirten oder beinhalten Disulfidbrücken, was die Expression zu einer Herausforderung macht. Die optimale Kombination aus Expressionsstamm und -plasmid (Promotor, Fusionspartner) muss dabei für jedes AMP empirisch ermittelt werden.
In dieser Arbeit wurde daher ein Expressionsscreening in E. coli entwickelt, mit dem für jedes AMP systematisch nach den Parametern gesucht werden kann, mit denen eine maximal hohe lösliche Proteinausbeute erzielt wird. Variiert wurden dabei die Elemente, aus denen das Expressionsplasmid aufgebaut ist, wie Promotor und Fusionspartner, sowie der Bakterienstamm. Dazu wurde mithilfe der Golden Gate-Klonierung eine kombinatorische Plasmidbibliothek aufgebaut, innerhalb derer durch die einfache und parallelisierbare Klonierungstechnik eine freie Kombination von Plasmidelementen zu Expressionsplasmiden möglich ist. Für drei Modell-AMPs mit unterschiedlichen Charakteristika wurde die Effizienz der Klonierung untersucht und das Expressionsscreening durchgeführt.
Für Insekten-AMPs, die sich aufgrund ihrer Eigenschaften nicht in E. coli exprimieren lassen, wurde ein Protokoll zur Herstellung stabil exprimierender, monoklonaler Schneider 2-Insektenzelllinien etabliert.
