Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) verursacht schwere invasive Infektionen oder auch Überempfindlichkeitsreaktionen bei immungeschwächten Menschen sowie Patienten, die an bereits bestehenden Lungenerkrankungen leiden. Die rechtzeitige Diagnose invasiver Pilzinfektionen ist nach wie vor schwierig, da spezifische und hochempfindliche nicht-invasive Methoden für A. fumigatus fehlen. Die Betrachtung der T-Helferzellantwort (CD4+) gegen spezifische Pilzpathogene kann dabei wichtige Informationen über den Wirt-Pathogen-Status liefern und diagnostisch für die Kategorisierung von Patientengruppen genutzt werden. Die Untersuchung der Rolle von Aspergillus-spezifischen Th-Zellen für die antimykotische Immunität des Menschen ist jedoch bei gefährdeten Patienten aufgrund der eingeschränkten Möglichkeiten zur Probenahme sowie des schnellen Fortschreitens der Erkrankung äußerst schwierig. In dieser Studie wurde das Hausschwein als translationales Großtiermodell ausgewählt, um die antimykotische T-Zell-Immunität gegenüber luftgetragenen A. fumigatus-Sporen unter Anwendung des Aktivierungsmarkers CD154 und der Anreicherung porziner Aspergillus-spezifischen T-Helferzellen zu untersuchen. Der Pool von A. fumigatus-reaktiven CD4+ T-Zellen im Blut gesunder, natürlich exponierter Schweine war bezüglich des Differenzierungsstatus, der Frequenz und des Th1-Phänotyps mit Daten gesunder Menschen vergleichbar. Gesunde Schweine, die in einer Aerosolkammer experimentell einer definierten Konzentration von 106 KBE/m3 Konidien über einen Zeitraum von 8 Stunden ausgesetzt waren, zeigten an Tag 4 nach der Exposition eine erhöhte Anzahl an Aspergillus-spezifischen Th-Zellen im Blut, gefolgt von einem Abfall und einem allmählichen Anstieg bis Tag 18. Nach der experimentellen Exposition akkumulierten A. fumigatus-reaktive CD4+ T-Zellen insbesondere in Lungengeweben und zeigten einen konsistenten Th1-Phänotyp. Experimentell exponierte Schweine entwickelten zudem keine klinischen Anzeichen einer Infektion. Eine temporäre medikamentös induzierte Immunsuppression vor der experimentellen Aspergillus-Exposition reduzierte die Anzahl der A. fumigatus-reaktiven Th-Zellen in Lungengeweben signifikant und resultierte in einer reduzierten Zytokinproduktion bis zu mehr als zwei Wochen nach Absetzen der supprimierenden Behandlung. Die initiale periphere A. fumigatus-reaktive T-Helferzellantwort im Blut war bemerkenswerterweise bei immunkompetenten sowie immunkompromittierten Schweinen sehr ähnlich. Darüber hinaus führte die experimentelle Exposition gegenüber Aspergillus-Konidien bereits nach 4 Tagen zu einem deutlichen Anstieg der pulmonalen Th17-Antwort mit Kreuzreaktivität gegenüber C. albicans. Die Ergebnisse unterstreichen daher den sinnvollen Einsatz von Hausschweinen zur Erforschung der A. fumigatus-reaktiven T-Helferzellantwort und bieten neue Anhaltspunkte zur Analyse prädisponierender Faktoren für Aspergillus-assoziierte Erkrankungen und des Potenzials der T-Zell-basierten Diagnostik und Therapie in Human- und Veterinärmedizin.
Aktualisiert: 2023-01-12
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"The role of the endothelin B receptor in the pulmonary Th2 inflammation"
Pulmonary arterial hypertension is a rare, deadly disease, which is characterized by endothelial dysfunction, pulmonary vasoconstriction, pulmonary vascular hyperresponsiveness and pulmonary arterial remodeling. The endothelin system plays a crucial role in the pathogenesis of PAH. Hence, the aims of this study were to examine the role of the endothelin system in Th2-induced PAH-associated pathologies as well as agedependent endothelin-1-mediated alterations of the pulmonary vasculature. Pulmonary Th2 inflammation was induced in mice by systemic ovalbumin sensitization followed by ovalbumin airway exposure (OVA/OVA). Isolated perfused and ventilated lungs of transgenic mice were investigated to determine the effects of endothelin receptor B deficiency (ETB-/-) and human prepro-endothelin-1 overexpression (ETtg) on mean pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular (hyper-) responsiveness. In addition, pulmonary collagen deposition and perivascular inflammation were examined by comparative histological analyses. Right ventricular hypertrophy was determined by Fulton index. Cytokine analyses of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and messenger ribonucleic acid analyses of lung homogenate allowed a specific characterization of the inflammation and regulatory mechanisms in the respective groups.
ETB-/- mice showed pulmonary hypertension, including pulmonary vascular hyperresponsiveness and right ventricular hypertrophy. Pulmonary vascular hyperresponsiveness and right ventricular hypertrophy aggravated following induction of pulmonary Th2 inflammation. OVA/OVA-treated ETB-/- mice showed markedly increased perivascular leukocyte infiltration, pulmonary endothelin-1 expression and BALF IL-12p40 levels in comparison to their corresponding wildtype animals. In addition, the endothelin-1-mediated pulmonary vascular release of thromboxane was distinctly augmented in ETB-/- mice. While prepro-endothelin-1 overexpression led to pulmonary vascular hyperresponsiveness in young ETtg animals, highly aged ETtg mice showed a fixed pulmonary hypertonus accompanied by right ventricular hypertrophy.
In summary, due to pulmonary Th2 inflammation, ETB deficiency led to an increased pulmonary leukocyte influx with markedly increased IL-12p40 levels and an enhanced expression of endothelin-1. These alterations as well as an increased pulmonary vascular release of thromboxane might have contributed to the increase in right ventricular hypertrophy and pulmonary vascular hyperresponsiveness, observed after OVA/OVA treatment. The results of this study support the hypothesis that endothelin receptor B plays a protective role in the pulmonary vascular system. Moreover, they show that endothelin-1 alone is sufficient to induce PAH-associated alterations in the heart and pulmonary circulation. Further studies, including separate and simultaneous inhibition of endothelin receptor A and/ or ETB, are needed to determine whether separate inhibition of endothelin receptor A could be superior to dual blockade of both endothelin receptors in PAH therapy.
Aktualisiert: 2023-02-16
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"The influence of different volume replacement fluids and continuous venovenous haemofiltration (CVVH) in a healthy pig model on the clinical chemistry and the histopathology of the liver"
The treatment of critically ill patients poses great challenges to medicine. The often multimorbid patients are subjected to a multitude of therapy components, which, in addition to anaesthesia, medication and parenteral nutrition, also include the administration of crystalloid or colloid volume substitutes and the use of extracorporeal organ-supporting systems. In clinical studies, usually only individual therapy components are considered and different concomitant therapies such as infusion management and the associated possible biocompatibility-related interactions are disregarded, which leads to contradictory results or makes comparability almost impossible.
Against this background, this animal experimental study in healthy pigs (n = 66) investigated volume replacement-specific effects of crystalloid and colloidal infusion solutions, with concomitant use of a venovenous haemofiltration circuit (CVVH) on blood chemistry and histopathological changes in the liver.
The experimental animals were randomly divided into control and CVVH groups and then assigned to five volume replacement agents (NaCl, HES130, HES200, albumin (ALB), gelatin (GEL)). The CVVH animals were connected to a haemofiltration circuit for a total of 6.5 hours and received an infusion of the volume replacement agent corresponding to their group during the entire time. Extensive measurements of blood parameters (electrolytes, creatinine, urea, blood proteins, colloid osmotic pressure, lactate, liver enzymes) were carried out at five defined time points. Immediately after the end of the experiment, the animals were euthanised. The livers were evaluated for signs of altered hepatic microcirculation and possible hepatocellular damage according to a histological scoring system.
Overall, the blood parameters remained largely within the physiological ranges. Higher chloride levels in the control and CVVH groups (NaCl, HES130, HES200) and higher sodium levels (NaCl, HES130, HES200, GEL) were related to the composition of the volume replacement fluid. Significantly higher creatinine values in the animals infused with GEL compared to the control and a divergent behaviour of the two HES preparations could be an indication of poorer creatinine clearance in the CVVH-GEL group. An increase in glucose concentration after bolus infusion, which was only observed in the two HES preparations, could be explained by the degradation pathway of the HES molecules to glucose. The consistently lower protein and albumin concentrations of the artificial colloids (HES130, HES200, GEL) compared to the ALB group, which were below baseline, indicated an influence on albumin homeostasis in the liver due to application of the artificial colloids.
Histopathological evaluation showed a lower degree of portal field oedema in all CVVH groups compared to their controls. Furthermore, the CVVH groups of NaCl, ALB and GEL showed significantly lower scores in the widening of the spaces of Disse and sinusoidal blood stasis compared to their controls. The two HES preparations behaved divergently. However, without a measurement of intrahepatic pressures and portal flow rates, the interpretation of these results is limited. In addition to improved haemodynamics under CVVH, a biocompatibility reaction with leukocyte activation, cytokine release and subsequent vasoconstriction must also be considered in view of the higher leukocyte counts with NaCl, ALB, GEL.
All CVVH groups showed a lower degree of hepatocellular vacuolisation in favour of a more pronounced oedematisation compared to their controls. This was interpreted as a lower affection of the liver cells, which was additionally reflected in blood chemistry by a lower release of AST in the animals of the HES130 and GEL group. Regrouping the experimental animals according to their mean histological score values (0-3), independent of the volume replacement fluid, showed that higher enzyme values tended to be associated with greater hepatocellular vacuolisation (AST) and greater hepatocellular oedematisation (ALT, LDH). An exclusive storage of HES molecules in the vacuoles of the liver cells could thus be disproved.
Overall, this animal study was able to show that the choice of volume replacement with simultaneous use of CVVH can lead to different biocompatibility reactions. In view of the small differences in the healthy pig model, which were already evident within a few hours, it seems advisable to consider corresponding protocol aspects in the design of future preclinical studies and to include this factor in corresponding multivariate analyses for clinical studies.
Aktualisiert: 2022-07-14
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Development and evaluation of polydioxanone-based microspheres as temporary embolization material for transarterial embolization in a rabbit kidney model
The objective/aim of the present animal study was to investigate the in-vivo behavior of novel temporary embolization microspheres made of polydioxanone. It is a hypothesis-generating primary study in which the basic properties (feasibility, safety, efficacy, resorbability and biocompatibility) of the newly developed material were examined in a renal embolization model in 16 clinically healthy New Zealand White.
For this purpose, newly size-calibrated (100-150 μm and 90-315 μm) and biodegradable microspheres made of polydioxanone were developed. The selective unilateral embolization of the kidney poles was performed randomized and under fluoroscopic control. The effectiveness of the embolization was confirmed by means of digital subtraction angiography (DSA) and magnetic resonance imaging (MRI).
Three animals (group 0) were euthanized immediately after embolization in order to assess the acute behavior of the particles. The remaining 13 animals were subjected to control imaging (DSA and MRT) after 1, 4, 8, 12 or 16 weeks to assess resorbability and reperfusion. This was followed by euthanasia and laboratory processing of the target organs for the histopathological examination of the resorbability and biocompatibility of the microspheres.
Renal embolization with polydioxanone microspheres was safe to perform in all rabbits. The injection through conventional catheter systems was moderately easy. The embolization resulted in an effective vascular occlusion, which was confirmed by DSA and MRI as well as in histopathology. The DSA and MRT controls after 1, 4, 8, 12, or 16 weeks showed partial to complete reperfusion as an indication of resorbability of the microspheres. The histopathological examination confirmed the resorbability through a microscopically visible and progressive particle degradation over time. The degradation of the microspheres was accompanied by a mild to moderate inflammatory / foreign body reaction with no evidence of tissue intolerance.
In conclusion the novel temporary embolization microspheres made of polydioxanone are characterized by good applicability and safety in the rabbit kidney embolization model, as well as reliable efficacy, resorbability and biocompatibility. In order to enable clinical application, biochemical modifications to the particles with the aim of accelerated degradation behavior and improved injectability are necessary.
Aktualisiert: 2022-05-05
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The effect of Baicalein on inflammatory cells and mediators in aortic aneurysm of mice
An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a pathological focal dilation of the abdominal aorta. Over 70 per cent of human patients die after a rupture of abdominal aortic aneurysm. This fact shows how important it is to explore the inflammatory development of aortic aneurysms. Nevertheless, the exact pathophysiological mechanisms are not revealed. The aim of this project was to investigate the effect of the anti-oxidative substance Baicalein on aortic aneurysm formation and the inflammation in a mouse model. Also the better understanding of the inflammatory pathway on development of aortic aneurysms should be explored.
The established Angiotensin II induced ApoE-/- -Mouse Model was used. During 4 weeks, 1500 ng/kg/min Angiotensin II was infused via an implanted osmotic pump (ALZET Modell 2004). Animals were classified in 4 groups. Group NaCl BAI- and NaCl BAI+ (n=10) had a saline infusion, Group Ang II BAI- and Ang II BAI+ (n= 30) were perfused with angiotensin II. The Groups NaCl BAI+ and Ang II BAI+ additionally received 1,5 mg/kg/day Baicalein via intraperitoneal injection. The aortic diameter, the peak systolic velocity and the mean velocity were measured weekly through the use of a duplex sonographer. After 4 weeks, the mice were sacrificed and the aortas were dissected. The aortas were stained with histological and immunohistochemical methods to locate the spread of immunological cells, apoptotic cells and the presence of inflammasome components in the aortic wall. Also the degeneration of the media (Grading 0-III) was staged via histological review.
There was no significant effect on mortality, diameter development and the incidence of aortic aneurysms with 30 percent in the verum-group in response to the injection of 1,5 mg/kg/day Baicalein. In addition, Baicalein treatment seems to be associated with the decrease of mortality and incidence of AAAs. Moreover, this dose did not change the presence and distribution patterns of inflammasoms in the aortic wall. Analyses of the medial degeneration seem to show a reduction through Baicalein.
The findings of this study in addition with the inhibition of AAA incidence and the decrease of AAA diameters of other investigations indicate that Baicalein might have an effect on the development of AAA.
Aktualisiert: 2022-05-05
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Atherosklerose ist von fundamentaler Bedeutung für zahlreiche kardiovaskulärer Folgeerkrankungen. Klinisch äußert sie sich meist erst nach Jahren oder Jahrzehnten durch Symptome ihrer Folgeerkrankungen. Die zentralen pathophysiologischen Faktoren dieser Erkrankung sind Endothelzelldysfunktionen, Ablagerungen von Blutfetten in den Gefäßwänden und chronische Entzündungsreaktionen. Kennzeichnend für Atherosklerose ist also die Ansammlung von proinflammatorischen Zellen und extrazellulären Matrixproteinen, wie Elastin, in der Gefäßintima. Ein Risiko für Atherosklerose ist die Plaqueruptur mit der subsequenten Bildung von Thromben, welche zu Herzinfarkten oder Schlaganfällen führen können. Präventionsansätze können die Mortalität dieser Krankheit drastisch senken. Die molekulare Bildgebung ermöglicht die nicht-invasive in vivo Visualisierung und Quantifizierung biologischer Prozesse auf molekularer und zellulärer Ebene. Diese Dissertation hat sich mit dem Potenzial der in vivo Magnetresonanztomographie für die molekulare Bildgebung von Atherosklerose befasst und neue Möglichkeiten in der Detektion dieser Erkrankung aufgezeigt.
Zum einen wurde im ersten Teil dieser Dissertation gezeigt, dass die elastinspezifische Sonde ähnliche Eigenschaften für die Durchführung von MR-Angiographien hat, wie klinisch verwendete Kontrastmittel. Dies ist von hoher Relevanz für die potentielle klinische Translation einer solchen Sonde.
Zum anderen konnte im zweiten Teil dieser Dissertation gezeigt werden, dass auf Basis einer simultanen molekularen MRT mit zwei Sonden die Charakterisierung der Plaquelast und der entzündlichen Aktivität von progressiver Atherosklerose im Mausmodell möglich ist. Der in vivo Nachweis und die Quantifizierung dieser mit Plaque-Instabilität verbundenen Biomarker in einem einzigen Scan können den Nachweis von instabilen Plaques ermöglichen und dadurch die Risikostratifizierung und Behandlungsführung von Patienten verbessern. Die duale Anwendung der elastin- und eisenoxidspezifischen Sonden bildet somit ein neuartiges Bildgebungsinstrument zur in vivo Charakterisierung der Plaqueruptur bei Atherosklerose.
Aktualisiert: 2021-10-21
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Zystische Fibrose (engl. cystic fibrosis, CF) entsteht durch Mutationen im cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) Gen, das für einen epithelialen Chloridionenkanal kodiert. Sie ist bis heute eine nicht vollständig verstandene, multisystemische Erkrankung, die zu Exokrinopathien in verschiedenen Organen führt. Trotz verbesserter Behandlungsmethoden versterben die Betroffenen heute durchschnittlich mit 50 Jahren größtenteils an progressiven Lungenentzündungen.
Schon bei der Geburt liegen strukturelle Veränderungen im Respirationstrakt vor, wie beispielsweise eine Deformation der Trachea und Wandverdickungen großer Bronchien, lange bevor sich eine Lungenentzündung entwickelt. Identische Malformationen fanden sich auch in CF-Schweinemodellen, bei denen porzines CFTR (pCFTR) durch genetisch Modifikation ausgeschaltet wurde. Die Bedeutung dieses angeborenen Phänotyps für die Pathogenese von CF ist noch unklar, jedoch lassen diese Beobachtungen eine Rolle von CFTR bereits in der pränatalen Organentwicklung vermuten. Bislang liegen allerdings nur wenige Daten hinsichtlich der pränatalen CFTR-Expression vor.
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war somit die Charakterisierung des stadien- und gewebeabhängigen Expressionsmusters von CFTR während der pränatalen Entwicklung im unteren Respirationstrakt und Dickdarm gesunder Wildtypschweine. Die Ergebnisse wurden mit bereits bekannten Erkenntnissen der pränatalen CFTR-Expression im Menschen verglichen. In die Analysen wurden Feten zu verschiedene Trächtigkeitszeitpunkten, neugeborene Ferkel und adulte Sauen eingeschlossen. Die gewebliche Expression von CFTR wurde auf mRNA-Ebene mittels Reverse Transkriptase quantitative Polymerase Kettenreaktion quantifiziert, das zelluläre Expressionsmuster mittels Immunhistochemie bestimmt. Des Weiteren wurde die gewebliche Expression des Natriumkanals pENaC, der ebenfalls eine Rolle in der Pathogenese von CF zu spielen scheint, sowie zelluläre Marker für Becherzellen (pCLCA1) und anderer Epithelzellen (pCLCA4a) analysiert.
Die Expression aller untersuchten Gene konnten mit einer Ausnahme auf mRNA-Ebene zu jedem untersuchten Zeitpunkt vom Ende des ersten Trimenon bis 24 Stunden postpartal und bei adulten Sauen nachgewiesen werden. Einzig im alveolarreichen Lungenhauptlappen konnte pCLCA4a im zweiten Trimenon nicht bei allen Feten nachgewiesen werden, was vermutlich mit einer zu geringen Expression zusammenhängt. Die Expressionsanalyse von pCFTR und pSCNN1B, das für pENaC kodiert, ließ, wie beim Menschen auch, markante Zeitpunkte erkennen. Beispielsweise zeigte sich eine erhöhte Expression von pCFTR und pSCNN1B im unteren Respirationstrakt und Dickdarm im zweiten Trimenon. Daneben fand sich eine auffällige Reduktion der Expression von pCFTR im alveolarreichen Hauptlappen und eine Erhöhung der Expression von pSCNN1B im bronchusreichen Lungenspitzenlappen zum Zeitpunkt der Geburt. Auch die mRNA der beiden analysierten Markergene pCLCA1 und pCLCA4a wurde vermehrt im zweiten Trimenon nachgewiesen, was wahrscheinlich mit der Differenzierung der einzelnen Zelltypen zu diesem Zeitpunkt zusammenhängt.
Mittels Immunhistochemie wurde pCFTR in epithelialen Zellen des Dickdarms zu jedem untersuchten Zeitpunkt nachgewiesen. In der Trachea konnte das pCFTR-Signal jedoch nur bei neugeborenen Ferkeln und adulten Sauen, nicht aber in pränatalen Stadien nachgewiesen werden. Dies ist möglicherweise auf die mangelnde Sensitivität des Antikörpers zurückzuführen.
Die pränatale pCFTR-Expression zeigte somit ein charakteristisches, zeitabhängiges und mit humanem CFTR vergleichbaren Expressionsmuster und war durch eine erhöhte Expression im 2. Trimenon im Respirationstrakt und im Dickdarm charakterisiert. Möglicherweise ist CFTR daher zu diesem spezifische Entwicklungszeitpunkt für die Organentwicklung relevant. Zukünftige Untersuchungen zu diesem Zeitpunkt sollten an CF-Schweinefeten durchgeführt werden, um mögliche Ursachen für die angeborene Organmalformationen zu identifizieren.
Aktualisiert: 2021-06-24
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Bluthochdruckpatienten haben ein deutlich erhöhtes Risiko einen Schlaganfall oder Herzinfarkt zu erleiden. Aber auch andere Endorgane wie die Nieren oder die Augen können durch den langanhaltend erhöhten Blutdruck schwerwiegende Schäden davon tragen. Seit den 50er Jahren stehen als Therapie sehr potente orale Medikamente zur Verfügung. Jedoch sind bis zu einem Drittel der Menschen mit arterieller Hypertonie therapierefraktär. Für diese Patientengruppe ist es dringend notwendig, dass neue effektive und sichere Therapieansätze entwickelt werden. In den letzten Jahren hat man daher das Konzept der renalen Denervierung wieder entdeckt und mit den neuen minimalinvasiven Techniken weiterentwickelt. Sie basiert auf dem Hintergrundwissen, dass die sympathischen Nervenfasern, welche periarteriell in der Adventitia der Nierenarterie verlaufen, maßgeblich an der Regulation des Blutdrucks beteiligt sind. Diese so zu schädigen, dass sie ihre Funktion verlieren, ist das Ziel der renalen sympathischen Denervation. 2009 schien man mit der Einführung des Symplicity-Katheters dieses Ziel erreicht zu haben. Dieser Katheter wird über einen femoralen Zugang bis in die Nierenarterie vorgeschoben um mittels einer Elektrode punktuell Radiofrequenzenergie an das umliegende Gewebe abzugeben. So werden die dort verlaufenden Nerven durch die Wärmeentwicklung deaktiviert. Die Symplicity HTN-3-Studie, welche erstmals randomisiert und verblindet war, konnte keine überzeugenden Ergebnisse hinsichtlich der Effektivität des Verfahrens liefern. Daher folgten diverse Studien, um neue Methoden zur renalen Denervierung zu erproben. Neben den thermischen Verfahren wie die RFA oder HIFU, ist auch die Verwendung neurotoxischer Substanzen erfolgreich in präklinischen sowie klinischen Studien getestet worden.
Aus anatomischen Gründen sind jedoch nicht alle refraktären Hypertoniker für den Einsatz des Symplicity-Katheters geeignet. Die Nierenarterie muss für diesen Eingriff z. B. eine vorgeschriebene Größe und Länge aufweisen. Zudem sind auch bestimmte Vorerkrankungen der Nierenarterien ein Ausschlusskriterium. Um diese Limitationen der Nierenarterie zu umgehen und den potentiellen zukünftigen Patientenkreis zu erweitern, untersuchten wir in dieser Arbeit einen neuartigen Zugangsweg zur Applikation der neurotoxischen Substanz. Ziel dieser Arbeit war es die Machbarkeit der renalen Denervation mittels katheterbasierter transaortaler Ethanolapplikation im Schweinemodell zu evaluieren. Dafür wurden 11 normotensive Tiere in Allgemeinnarkose behandelt. Über die A. femoralis wurde unter Fluoroskopie ein Katheter mit steuerbarer Spitze und einer experimentellen ein- und ausfahrbaren Injektionsnadel bis in die Aorta vorgeführt. Nach Penetration der Aortenwand knapp oberhalb des Ostium renalis wurde ein Gemisch aus Kontrastmittel, Lokalanästhetikum und Ethanol injiziert. Die unbehandelte Seite diente als Kontrolle. Nach 4 Wochen Standzeit wurden die Tiere euthanasiert und der NA-Gehalt im Nierenparenchym gemessen, sowie die Nierenarterie und ihre umliegenden Strukturen histologisch untersucht. Außerdem wurde der Blutdruck unmittelbar vor und nach der Intervention sowie am Tag der Euthanasie nicht invasiv am narkotisierten Tier gemessen.
Zusammenfassend kann man sagen, dass das Verfahren bei 10 von 11 Tieren technisch durchführbar war. Ein Tier verstarb aufgrund von Kreislaufversagen in der Aufwachphase, was aber nicht in Verbindung mit der Intervention zu sehen ist. Bei einem anderen Tier kam es infolge einer versehentlichen intraarteriellen Ethanolinjektion zur Thrombosierung und Infarzierung der behandelten Niere. Bei 3 Schweinen ist das Injektat auch auf die kontralaterale Seite geflossen. Betrachtet man die technisch optimal durchgeführten Eingriffe, gab es einen messbaren NA-Abfall auf der behandelten Seite, jedoch war dieser nicht signifikant. Histologisch waren auf der behandelten Seite deutlich degenerierte Nerven nachweisbar. Der Blutdruck hat sich, wie bei einer einseitigen Denervation zu erwarten war, über die Zeit nicht verändert. Es sind weitere Studien nötig, um festzustellen ob die Ethanolinjektion über einen transaortalen Zugang eine Alternative zu der perkutanen oder transarteriellen Applikation darstellen kann.
Aktualisiert: 2021-11-11
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Influence of combined mechanical and biological stimulation on defect healing – a microcomputed tomographic and biomechanical study of critical-sized bone defects in rats
Generally it is known that the mechanical environment (stiffness of stabilization measures) is significant for the healing success of a fracture (Histings et al., 2010; Bartnikowski et al., 2017; Claes, 2017; Glatt et al., 2017). Under which biomechanical conditions a fast and efficient fracture healing would be achievable has been the subject of intensive research for some time (Claes, 2017).
Additionally, several studies have shown the positive effect of BMP-2 for bone healing (Nauth et al., 2011; Wildemann et al., 2011). Extended knowledge of the impact of the dosing of growth factors and how much their interaction with mechanical stress can influence the efficiency of bone regeneration show possible future strategies for cases in which a bony bridging of the fracture gap has not yet been achieved. (Schmidt-Bleek & Willie et al., 2016).
The aim of this work was to analyze the effects of varying fixation stiffness in combination with BMP-2 treatment in a critical sized defect (CSD) in a rat.
32 female Sprague Dawley rats, 12 weeks old, were randomized in four groups each of eight animals. Three experimental groups received a standardised critical 5 mm defect, 5μg rhBMP-2 was loaded on a absorbable collagen sponge and placed into the defect and stabilized with a flexible, semi-ride or rigide connecting element of the external fixator. The control group (1 mm osteotomy) mimicked an uncritical healing and was stabilized with the rigid fixator. All groups were analysed by in vivo micro-CT, perforrmed at day 10, 21 and 42 post-operation. At day 42 the rats were sacrificed and the osteomised left femora (including external fixator) were harvested. Additionally, the right intact femur of seven animals was harvested randomizedly. In the following, all samples were analysed by biomechanical in vitro testing for torsional stiffness and maximal torque value.
The initial healing process of the stiffness groups was found with comparable tissue structure in the descriptive micro-CT. At day 10, in all stiffness groups moderate bone formation was detected along the periosteal defect site that was not sufficient for defect bridging. However, among the other stiffness groups, upon semi-rigid fixation, a tendency towards a higher level of mineralization was still found, which correlates with the largest statistically not significant TV-, BV- und TMC-values. Whereas the flexible group showed the lowest TV-value.
On day 21 defects were bridged with bone tissue in all stiffness groups. As a result of the beginning maturing process, the micro-CT showed reabsorption processes. Delayed healing was found upon flexible fixation towards the other stiffness groups. Also a defect site with calcified and mineralized callus was found.
On day 42, the flexible group showed significantly higher values for TV, BV, BV/TV and TMC, whereas the semi-rigid group showed the smallest of these values. This was seen by a defect site filled with mineralised callus upon flexible fixation, whereas the
other stiffness groups had already shown reabsorption processes with rebuilding of the medullary cavitiy. Regarding TMD, the semi-rigid group showed the highest value, while flexible group showed the lowest value, but without any significance. The rigid group and the semi-rigid group showed a reduction of the total volume (TV) and also lower BV- and TMC-values as the flexible group - but also a lower TMD-value as the semi-rigid group. This leads to the presumption of a delayed maturing process.
By using biomechanical in vitro tests, the semi-rigid group showed nearly equivalent results respective the torsional stiffness and the maximal torque at failure between the rigid and the flexible group.
This study has shown that the BMP-2-stimulated defect healing is mechano-sensitive. Although marginal statistically significant differences in biomechanical and micro-CT results have been found, an accelerated healing process has been demonstraded upon semi-rigide and rigide group contrary to the flexible fixation – indicating a delayed boost of bone formation, whereas other stiffness groups had already shown reabsorption processes with rebuilding of the medullary cavitiy. This leads to the insight that the modulation of the mechanical environment of the critical defect has an impact on the healing process, despite the same BMP-2-treatment.
Aktualisiert: 2021-04-16
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Lungs often have to be rejected from transplantation because they unfortunately include edema, atelectasis and immigrated inflammatory cells or pneumonia (van Raemdonck et al. 2009).
The in vitro reconditioning of lungs as a strategy to improve the mismatch between the need for donor lungs and the organs suitable for transplantation was pursued in a project to optimize a reperfusion model in lung transplants at the University Hospital Eppendorf in Hamburg. In this project, an ex vivo reconditioning system with a protocol for the reconditioning and an as optimal as possible reperfusion cycle was developed. The influence of the system structure and the perfusion solution as well as pulmonary damage by aspiration was also investigated (Wipper et al. 2007, 2008, 2009, 2010, 2011).
The aim of this research was to clarify the extent to which tight-junction, adherence junction and gap-junction proteins change due to the influence of reconditioning, the different system components and the damage of the lungs by aspiration and their different treatments. Additionally an investigation as to how clinical and histological parameters of the project and from this research correlate were conducted. There is already evidence that tight-junction proteins (reviewed by Cummins 2012), adherence binding proteins (De Boer et al. 2008), and gap-junction proteins (Sarieddine et al. 2009) play a role in lung disease.
To clarify this question, an immunofluorescence microscopic examination of the experimental groups of the project was carried out and the intensity of the fluorescence in the respiratory epithelium, endothelium and alveolar septa was evaluated.
As representatives of the tight-junction proteins Claudin-3, Claudin-4 and Claudin-5, Occludin and ZO-1 were selected. β-Catenin and E-Cadherin were studied as representatives of the adherence-binding proteins and Cx43 as representative of the gap-junction proteins.
The results of this study show that changes in the fluorescence intensity of the investigated proteins are observed, compared to healthy lung (prae-group); especially, in the endothelium and attenuated also in the alveolar septa in the aspiration groups of the project, in which also the clinically functional values and the LIS are changed. Claudin-5 and Occludin are reduced there, while Claudin-3 is increased. Cx43 is also elevated in these groups. Interestingly, in the aspiration group, where antithymocyte globulin was added in addition to the reconditioning and the intensive care measures, there are no changes in Claudin-5 and Cx43 and these values are consistent with the good clinical and histological values.
It is also noticeable in the respiratory epithelium that occludin is decreased in the investigated aspiration groups.
In the experimental groups of the closed system, there are hardly any changes in the fluorescence intensity compared to the prae-group. An exception is ß-Catenin, which is partially significantly reduced in the endothelium. However, ß-Catenin is reduced in all groups of the project.
When comparing the closed system with the open system (group 3, which was used as a control group of the aspirational experiments), for some proteins it is noticeable that the closed system is somewhat closer to the condition of the healthy lung. For occludin this is evident in all three localizations (endothelium, respiratory epithelium and alveolar septa) but also for Claudin-5 and Cx43 in the endothelium.
In summary, it can be said that the experimental influences of this project have a clear influence on tight-junction, adherence and gap-junction proteins. This shows that these proteins are involved in the mechanisms that underlie the (patho-) physiological changes.
Aktualisiert: 2022-12-31
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"Immunohistochemical and behavioral studies of postsynaptic serotonin1a receptor effects on adult neurogenesis"
With around 322 Million affected people worldwide and an increasing prevalence, depression is one of the most prevalent mental illnesses. The exact pathophysiological mechanisms of this disease have not been fully elucidated. In addition pharmacological therapy of depression comes along with a high non-responder rate and numerous adverse drug reactions. Further understanding of the etiology of depression is required to develop novel antidepressants with better efficacy and fewer adverse drug reactions. Studies of humans and animals suggest a dysregulation of the serotonergic system as well as alterations of adult neurogenesis in the development of depression. The 5-HT1A receptor, a subtype of the serotonin receptor family, was focussed in research and seems to play a significant role in the etiopathology of depression and the regulation of adult neurogenesis.
The 5-HT1A receptor is presynaptically located as an autoreceptor on serotonergic neurons in the raphe and postsynaptically as a heteroreceptor in the projection regions of serotonergic neurons such as the hippocampus. The well-established transgenic mouse model with an overexpression of postsynaptic 5-HT1A receptor (OE mouse) offers a good possibility to specifically investigate the effects of this receptor on adult neurogenesis, depression-like behavior, and hippocampus-dependent learning. Previous studies with OE mice indicate an antidepressant and proneurogenic effect of the postsynaptic 5-HT1A receptor. However, in these studies untreated or one-time treated mice were tested and, thus, compensatory mechanisms cannot be excluded. The present study aimed at analyzing the effects of chronic 5-HT1A receptor activation on adult neurogenesis, depression-like behavior and hippocampusdependent learning in OE mice compared to wildtype (WT) mice.
Furthermore, it is known that the serotonergic system is involved in the regulation of exerciseinduced adult neurogenesis. However, the proneurogenic effect in exercise-induced adult neurogenesis has not been related to any serotonin receptor-subtype yet. In this study, the involvement of the postsynaptic 5-HT1A receptor in exercise-induced adult neurogenesis was analyzed in the OE model. Both male and female mice were tested due to gender-specific differences in the prevalence and pathophysiology of the 5 HT1A receptor in depression as well as gender-specific differences in OE mice found in previous studies. After chronic 8-OH-DPAT or vehicle administration and in vivo labeling with BrdU, immunohistochemical studies for quantification of cell proliferation and survival in the dentate gyrus of male and female OE and WT mice were carried out. For analyzing exercise-induced adult neurogenesis a subgroup of both OE and WT mice had access or no access to a running wheel, respectively. Depression-like behavior of chronic 8-OH-DPAT or vehicle-treated OE and WT mice and untreated control animals was studied using the forced swim test and sucrose preference test. Differences in hippocampus-dependent learning of OE and WT animals were tested in the novel object recognition test and the novel object location test.
Voluntary wheel running was able to increase cell proliferation and survival in WT and OE mice. Considering the reduced distance traveled by OE mice, postsynaptically located 5-HT1A receptors are assumed to mediate a proliferative effect in exercise-induced adult neurogenesis.
Chronic 5-HT1A receptor activation did not result in increased cell proliferation or survival in either the transgenic mouse model or in WT animals. Female OE mice even showed a lower survival rate after chronic 5-HT1A receptor activation compared to WT animals and, correspondingly, depression-like behavior. The studies on hippocampus-dependent learning revealed no differences between OE and WT animals or the different treatment groups according to the results of cell survival. It is assumed that, in addition to 5-HT1A receptor desensitization after chronic receptor activation, mainly stress-causing factors such as injection and isolation were responsible for the present results. In conclusion, the results of our study, together with the results of a recent study on stress behavior of the OE mouse, indicate an increased stress sensitivity of the OE mouse. An interaction of sex hormones with postsynaptic 5-HT1A receptors as well as a decreased basal brain 5-HT concentration in female OE animals may result in a reduced cell survival rate and depression-like behavior of female OE animals following chronic 5-HT1A receptor activation. An analysis of stress response, the measurement of stress hormone concentrations such as corticosterone in blood and the determination of basal brain 5-HT concentrations in female transgenic mice are required to strengthen this assumption.
Aktualisiert: 2022-12-31
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Die intramedulläre Osteosynthese der Tibia mit einem Marknagel ist eine häufig angewandte Methode zur Frakturstabilisierung bei unfallchirurgischen Operationen. Jedes Material, welches in den Körper implantiert wird, stellt jedoch ein erhöhtes Risiko für eine bakterielle Oberflächenbesiedlung dar (Gristina et al., 1988). Dies begünstigt die Entstehung von tiefen Wundinfektionen (Jansen & Peters, 1993). Implantatassoziierte Infektionen gehören noch immer zu den schwerwiegendsten Komplikationen bei der Frakturversorgung. Mithilfe einer biodegradierbaren Implantatbeschichtung lassen sich Wirkstoffe zur kontrollierten Freigabe in einen polymeren Trägerstoff einarbeiten (Lucke et al., 2003). Das Implantat kann dadurch als sogenanntes „Drug-Delivery-System“ fungieren (Fuchs et al., 2011). Mit Hilfe eines solchen Systems kann eine lokale antibiotische Wirkung im Frakturgebiet erzielt werden, wodurch das Risiko einer bakteriellen Kolonisation reduziert wird (Lucke et al., 2003). Darüber hinaus lassen sich mögliche unerwünschte Arzneimittelwirkungen einer systemischen antibiotischen Applikation durch eine lokale antibiotische Therapie einschränken.
Die vorliegende Arbeit umfasst eine detaillierte in-vitro und in-vivo Analyse der Wirkstofffreisetzung bzw. –anreicherung des in die Polymerbeschichtung Poly(D,L-Laktid) eines Titankirschnerdrahtes eingearbeiteten antibiotischen Wirkstoffs Gentamicin. Für die in-vivo Studie wurden gentamicinbeschichtete Titankirschnerdrähte in den Tibiamarkraum von Ratten implantiert und nach verschiedenen Zeitpunkten, über eine Dauer von 42 Tagen, entnommen. Zur Darstellung der in-vivo Freisetzungskinetik erfolgte eine Quantifizierung der Gentamicinkonzentration auf dem Implantat, im Knochen, im Endost, in der Niere sowie im Serum der Ratten. Weiterhin erfolgten röntgenologische, histologische und immunhistologische Analysen, die es ermöglichten Kenntnis über die Verteilung und Anreicherung von Gentamicin in den oben genannten Geweben zu erlangen.
Die Freisetzungskinetik des lokal verabreichten antibiotischen Wirkstoffs Gentamicin zeigte in-vitro und in-vivo einen ähnlichen Verlauf. Sowohl in-vitro als auch in-vivo erfolgte ein initialer Anstieg der Gentamicinfreisetzung. Zum Untersuchungszeitpunkt „eine Stunde“ nach Implantation der Titankirschnerdrähte konnten die höchsten Gentamicinkonzentrationen in allen analysierten Geweben und auf den Titankirschnerdrähten ermittelt werden. Über den gesamten Untersuchungszeitraum von einer Stunde bis 42 Tage konnte der Wirkstoff Gentamicin im Endost nachgewiesen werden, wobei bis zum Zeitpunkt „vier Stunden“ nach Implantation der Titankirschnerdrähte eine antimikrobiell wirksame Gentamicinkonzentration erreicht wurde. Die radiologische Untersuchung der Tibia zeigte keine Anzeichen einer destruktiven Veränderung des Knochens durch das Implantat und dessen Beschichtung. Dies weist auf eine gute Biointegrität von Implantat und Beschichtung hin. Die immunhistochemische Färbung mit der Avidin- Biotin- Complex- Methode zeigte eine Akkumulation des Gentamicins im Bereich der Nierenrinde, was vermutlich auf die renale Elimination des Wirkstoffes zurückzuführen ist. Das zum Ausschluss einer Toxizität des aus der Polymerbeschichtung freigesetzten Gentamicins histologisch untersuchte Nierengewebe, zeigte keine Anzeichen entzündlicher oder nekrotischer Prozesse. Da die renale Exkretionsrate im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht ermittelt wurde, erfolgte keine Berechnung der absoluten in-vivo freigesetzten Gentamicinkonzentration. Die Kombination der verschiedenen Methoden zur Quantifizierung und Darstellung von Gentamicin in den Geweben, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurden, erlauben es, Informationen über die Akkumulation und die Aktivität des lokal freigesetzten Antibiotikums über den gesamten Untersuchungszeitraum zu sammeln. Aufgrund der beschriebenen Gefahr der Ausbildung einer bakteriellen Infektion infolge einer Tibiafraktur, als auch nach Frakturstabilisierung, ist eine schnellstmögliche lokale antibiotische Aktivität notwendig.
Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass durch den Einsatz von Poly(D,L- Laktid) beschichteten Titankirschnerdrähten, mit dem inkorporierten Wirkstoff Gentamicin, in den ersten vier Stunden postoperativ antimikrobiell wirksame Gentamicinkonzentrationen im Operationsgebiet erreicht werden können. Ferner wurden radiologisch sowie histologisch keine Anzeichen unerwünschter Arzneimittelwirkungen des Gentamicins in den untersuchten Geweben nachgewiesen. Mit Poly(D,L- Laktid) und Gentamicin beschichtete Osteosynthesematerialien scheinen somit für eine perioperative Antibiotikaprophylaxe, gegebenenfalls ergänzend zu einer systemischen Antibiotikatherapie, geeignet zu sein.
Aktualisiert: 2022-12-31
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Die CLCA-Proteinfamilie (engl. chloride channel regulators, calcium-activated) ist seit mehreren Jahrzehnten Forschungsschwerpunkt verschiedener Arbeitsgruppen weltweit. Sie umfasst komplexe, hochkonservierte Proteine mit einem weiten, Spezies-spezifischen Expressionsmuster. Vor allem das CLCA1-Protein, welches von Mukus-produzierenden Zellen insbesondere des Respirations- und Intestinaltraktes synthetisiert und vollständig sezerniert wird, scheint beim Menschen und bei der Maus pleiotrope, wenn auch bislang nicht vollständig erforschte Funktionen aufzuweisen und konnte mit relevanten, Mukus-assoziierten, humanmedizinischen Erkrankungen wie der zystischen Fibrose (Mukoviszidose), dem Asthma oder der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung in Verbindung gebracht werden. In jüngst publizierten Studien wurden für das CLCA1-Protein vor allem Funktionen als Mukusprozessor, Immunmodulator und Tumorsuppressor hypothetisiert.
In zunehmendem Maße stellen genetisch-veränderte Mauslinien exzellente Modelle für humanmedizinische Erkrankungen, stets unter Beachtung der komplexen Speziesunterschiede, dar. So wurden auch für das Clca1-Gen Knockout-Modelle generiert und bisher für vorrangig inflammatorische Fragestellungen eingesetzt. In naiven, spezifiziert pathogenfreien Clca1-Knockout-Mäusen (hier: Clca1-/-) konnte bis zu einem Alter von neun Monaten bislang kein Phänotyp beschrieben werden. In bakteriell und chemisch induzierten Entzündungsmodellen der Lunge, des Darms und der Gelenke zeigte die adulte Clca1-/--Maus in einem Alter von bis zu 16 Wochen einen immunmodulatorischen Phänotyp. Ältere Mäuse entwickeln jedoch über ihre Lebenszeit eine Reihe pathophysiologischer Veränderungen, wie z.B. Tumore sowie entzündlichen oder degenerativen Erkrankungen als Teil des natürlichen Alterungsprozesses.
Bisher ist über die Rolle des CLCA1-Proteins im Prozess des Alterns und der damit einhergehenden Entwicklung von alterstypischen, pathologischen Veränderungen nichts bekannt. Ziel dieser Studie war es daher, die Auswirkungen des Fehlens von CLCA1 auf den Alterungsprozess von Mäusen zu untersuchen. Ferner sollte festgestellt werden, ob das Fehlen von CLCA1 Auswirkungen auf die Ausbildung von alterstypischen Veränderungen hat und somit das Fehlen des Proteins einen Einfluss auf den Gesundheitszustand der Mäuse im Alter nimmt. Um dies zu erreichen, wurde die alternde Clca1-/--Maus umfassend phänotypisiert. Dafür wurden sowohl klinische Untersuchungen wie die Bestimmung des Körpergewichts sowie hämatologischer und klinischer Parameter als auch eine vollständige pathologische Untersuchung mit Bestimmung der Organgewichte und makroskopischer sowie histopathologischer Untersuchung durchgeführt. Es wurde das Modell einer Querschnittsaltersstudie gewählt, um zu definierten Zeitpunkten eine identische Anzahl von alternden Clca1-/--Mäusen mit deren WT-Geschwistertieren hinsichtlich der Ausbildung von pathophysiologischen Veränderungen vergleichen zu können.
In dieser Studie konnte für die alternden Clca1-/--Mäuse kein ausgeprägter, einheitlicher und somit offensichtlicher Phänotyp identifiziert werden, was eine essentielle Funktion des CLCA1-Proteins im Alterungsprozess sehr fraglich erscheinen lässt. Dennoch konnten in Einzelfällen Auffälligkeiten und initiale Beobachtungen für einen möglichen Altersphänotyp aufgezeigt werden. Während sich die Mäuse der beiden Genotypen mit altersgemäßer Physiologie in den klinisch erhobenen Parametern nicht unterschieden, konnten in der pathologischen Untersuchung, wenn auch ohne statistische Signifikanzen, erste initiale Hinweise auf das mögliche Vorliegen eines Altersphänotyps der Clca1-/--Maus im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrolltieren festgestellt werden. Trotz einer höheren Anzahl „systemisch“ erkrankter Tiere im hohen Alter wies die Clca1-/--Maus eine höhere Überlebensrate auf. Ihre Neigung zur Ausbildung inflammatorischer Erkrankungen, wie z.B. der C57BL/6-Dermatitis oder einer Pyometra, schienen hierbei erhöht, wohingegen chronische Entzündungen der Niere und der Zahnalveolen erst zu einem späteren Zeitpunkt auftraten. Hier könnten ähnliche, immunmodulatorische Funktionen es CLCA1-Proteins bei Entzündungen eine Rolle spielen, wie sie bereits mehrfach für verschiedene Mausmodelle publiziert wurden. Ebenso wiesen die hier erhobenen Befunde der Clca1-/--Maus auf ein mögliches erhöhtes Metastasierungsrisiko hämatopoetischer Neoplasien, auf eine mögliche erhöhte Neigung zur Ausbildung endokriner Adenome sowie zu Tumoren des Genitaltraktes hin, was eine bereits hypothetisierte Funktion von CLCA1 als Tumorsuppressor durchaus bestärken könnte. Inwiefern es sich bei den getroffenen Beobachtungen um direkte Auswirkungen des Fehlens des CLCA1-Proteins oder um zufällige Variationen handeln könnte, konnte aufgrund der niedrigen Prävalenz der Befunde sowie der geringen Gruppengrößen nicht abschließend beurteilt werden.
Mit dieser Altersstudie konnte ein erster Überblick über einen möglichen Phänotyp in der alternden Clca1-/--Maus aufgezeigt werden. In Einklang mit der bisherigen Literatur wurden eine etwaige immunmodulatorische Funktion sowie die Rolle von CLCA1-Proteinen bei Tumorerkrankungen weiter in den Fokus gerückt. Diese initialen Beobachtungen geben wichtige Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen, vor allem hinsichtlich der Fragestellung, warum manche Pathogene oder Stimuli eine vermehrte und andere wiederum eine reduzierte Immunantwort hervorrufen könnten. Ebenso sollten für die Maus, ähnlich wie bereits für einige humane Tumore durchgeführt, Untersuchungen hinsichtlich einer möglicherweise erhöhten Tumoraggressivität und -metastasierungsrate bei Verlust des CLCA1-Proteins angestrebt werden.
Aktualisiert: 2022-12-31
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Schizophrenie ist weltweit eine der häufigsten und schwerwiegendsten psychiatrischen Erkrankungen. Trotz der Anwendung von modernsten Antipsychotika in Kombination mit individueller Psychotherapie leiden ungefähr 30 % der Patienten unter Rückfällen oder sprechen nur unzureichend auf die pharmakologische Behandlung an. Deshalb ist es wichtig, nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten zu suchen. Eine vielversprechende Methode ist die transkranielle Magnetstimulation, da sie nicht-invasiv und schmerzfrei am Patienten angewendet werden kann. Mittels einer Magnetspule wird ein Magnetfeld erzeugt, das in der Lage ist über Depolarisation von Nervenzellen auf kortikale Bereiche des Gehirns erregend oder auch hemmend einzuwirken. Dadurch können Veränderungen in der Hirnaktivität, wie sie bei neuropsychiatrischen Krankheiten vorkommen, beeinflusst werden. Um die pathologischen Veränderungen im Gehirn hervorzurufen, wird in diesem Projekt das Poly(I:C)-Modell maternaler Immunstimulation an Ratten angewendet. Auf die Plastizität der Nervenzellen im Gehirn kann während seiner Entwicklung am meisten eingewirkt werden, daher findet die Magnetstimulation noch vor der Pubertät der Ratten im Alter von 6 Wochen statt. Verwendet wird ein intermittierendes Theta-Burst Protokoll repetitiver Stimulation.
Da die vollständige Ausprägung des Verhaltensphänotyps bei Schizophrenie erst im Erwachsenenalter auftritt, werden die Ratten im Alter von 12 Wochen in verschiedenen Verhaltensexperimenten getestet. Dazu gehören das Elevated Plus Maze, der Novel Object Recognition Test, das Morris Water Maze, der Pre-Pulse Inhibition Test, der Sucrose Consumption Test und der Porsolt Forced Swim Test. Anschließend wird eine Immunhistochemie der Gehirne mit den neuronalen Aktivitätsmarkern NeuN, Parvalbumin, Calbindin, cFos, Glutamat-Decarboxylase 67 und BDNF angefertigt.
Es konnten sowohl Unterschiede zwischen NaCl Kontroll- und Poly(I:C)-Tieren als auch zwischen Verum und Sham iTBS behandelten Tieren gefunden werden. Die Poly(I:C)-Tiere waren im Elevated Plus Maze weniger ängstlich als die Kontrolltiere. Nach der iTBS Behandlung kehrte sich dieses Verhältnis um. Im Novel Object Recognition Test zeigten die Poly(I:C)-Tiere ein Defizit im Langzeitgedächtnis, wohingegen sie im Morris Water Maze an den Tagen 2 und 4 hinsichtlich räumlichem Lernen und Gedächtnisbildung besser abschnitten als die anderen Gruppen. Im Porsolt Forced Swim Test waren die Sham-Kontrolltieren am inaktivsten. Es konnten keine Unterschiede zwischen den Gruppen im Pre-Puls Inhibition Test gefunden werden. In der Immunhistochemie sank die Expression von cFos und der Glutamat-Decarboxylase 67 im präfrontalen Kortex nach iTBS signifikant. Im Nucleus accumbens und dem ventralen tegmentalen Areal stieg die Expression von Calbindin und Glutamat-Decarboxylase 67 nach iTBS in den Poly(I:C)-Ratten signifikant an, wohingegen die Expression von cFos im ventralen tegmentalen Areal sank. Die Ergebnisse im dorsalen und ventralen Hippocampus waren sehr unterschiedlich.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein Langzeiteffekt der iTBS vorhanden ist und sie das Lernen in Poly(I:C)- und Kontrolltieren fördert. Allerdings haben viele Faktoren, wie das Handling, das Alter der Tiere und der Zeitraum zwischen Stimulation und Verhaltensversuchen, einen Einfluss auf die Ergebnisse. Die nicht vorhandenen Defizite im Pre-Puls Inhibition Test, welche normalerweise ein typisches Merkmal der Poly(I:C)-Tiere sind, sind ein Anzeichen dafür.
Aktualisiert: 2019-12-31
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Die Behandlung segmentaler Knochendefekte kritischer Größe, die durch Traumata, Tumorresektion oder Infektionen hervorgerufen werden, sowie die mechanobiologische Wiederherstellung der Gliedmaße, stellen nach wie vor eine Herausforderung in der Unfallchirurgie dar. Aufgrund dessen werden alternative Behandlungsmethoden von kritischen Knochendefekten zunehmend erforscht. Mit Hilfe der Laser-Sinterungstechnik hergestellte dreidimensionale Titan Mesh Scaffolds stellen eine vorteilhafte Alternativmethode zu den bekannten ,,Gold Standards“ dar und ließen beim klinischen Einsatz am humanen Patienten vielversprechende Rückschlüsse zu. In der vorliegenden Studie wurden mittels der Laser-Sinterungstechnik zwei Titan Mesh Scaffolds hergestellt, die strukturell gleich waren, sich jedoch in ihren Steifigkeiten voneinander unterschieden. Die Titan Mesh Scaffolds besaßen eine Honigwabenform und bildeten ein makro-poröses Netzwerk mit einer zentralen Pore. Durch die Veränderung des Strebendurchmessers der Titan Strut Elemente, entstanden zwei Titan Mesh Scaffolds mit unterschiedlichen Steifigkeiten. In der vorliegenden Studie erfolgte die Durchführung der 40 mm großen Osteotomie an der Tibia von zwölf Merino-Mix-Schafen. Es wurden zwei Gruppen mit jeweils sechs Tieren gebildet. In der einen Gruppe wurde der weiche Titan Mesh Scaffold mit einem Strebendiameter von 1.2 mm mit 0,84 GPA eingesetzt und bei der anderen Gruppe der 3,5-fach steife Titan Mesh Scaffold mit einem Strebendiameter von 1.6 mm mit 2,88 GPa eingesetzt. Die mit autologer Spongiosa befüllten Titan Mesh Scaffolds wurden in Kombination mit einem experimentellen winkelstabilen Plattensystem (AO-Platte), welches ausschließlich eine axiale Belastung der Gliedmaße zuließ, in den kritischen Osteotomiedefekt von 40 mm Größe in die Schafstibia eingesetzt. Während der Versuchszeit von 24 Wochen wurden monatliche Röntgenkontrollen durchgeführt. In der 24. Woche wurden ex vivo zusätzlich zu den konventionellen Röntgenaufnahmen, Aufnahmen im Faxitron angefertigt. Histologische und histomorphometrische Untersuchungsergebnisse wurden erfasst und evaluiert.
Der Einsatz des weichen und des 3,5-fach steiferen Titan Mesh Scaffolds in Kombination mit der experimentellen winkelstabilen AO-Platte erwies sich als eine adäquate Stabilisierungsmethode für einen kritischen Defekt von 40 mm Größe im Schafmodel. Die Hypothese, dass eine mechanisch-biologische Optimierung des Titan Mesh Scaffolds zu einer Förderung der endogenen Knochendefektregeneration führt, konnte histomorphologisch vermutet werden, da der Einsatz des weicheren Titan Mesh Scaffolds deskriptiv zu einer vermehrten Kallusbildung im Vergleich zu dem steiferen Titan Mesh Scaffold, zu beobachten war. Das Ergebnis konnte histomorphometrisch nicht bestätigt werden, da im Vergleich der beiden Gruppen kein statitisch signifikanter Unterschied vorlag.
Die AO-Platte wurde speziell für das Schaf entwickelt, stabilisierte den Fakturspalt ohne den Einsatz weiterer Stabilisierungsverfahren und gewährleistete zusätzlich eine artgerechte Haltung der Schafe. Die Titan Mesh Scaffolds füllten den Defekt gut aus und erwiesen sich als stabil, sie verhinderten einen Muskel- und Weichteilprolaps in den Defekt und dienten darüberhinaus als Leitstruktur für das wachsende Gewebe. Da nach 24 Wochen keine komplette Überbrückung des Defektspaltes zu beobachten war, lag eine verzögerte Heilung vor. Die mechanische Belastung im Frakturspalt wurde durch die Titan Mesh Scaffolds in Kombination mit der AO-Platte minimiert, sodass die Kallusformatinon gering war. Dennoch zeigte die Gewebezusammensetzung eine noch aktive Knochenheilung. Die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse können genutzt werden, um die Kombination des Titan Mesh Scaffolds mit einer anderen Platte, die mehr mechanische Bewegung im Frakturspalt ermöglicht und demnach zu einer vermehrten Kallusbildung führen könnte, zu untersuchen.
Aktualisiert: 2019-12-31
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Systemic interactions between the ischemic brain and the heart
Objectives:
To implement a murine model of reperfused acute ischemic stroke (AIS) to study local cardiac and circulatory adaptations
Background:
Cardiac prognosis in patients with AIS is impaired. Frequent coincidental findings after AIS are systemic inflammation and release of high sensitive Troponin T (hsTnT) with cardiac dysfunction. The nature of cardiac dysfunction and potential therapeutic targets are not known. Standardized models to investigate systemic interferences of the brain-heart-axis and the underlying mechanisms of AIS induced cardiac dysfunction are missing.
Methods:
Ischemic stroke was induced in 109 C57BL/6J mice by transient right-sided middle cerebral artery occlusion (tMCAO). Cardiac effects were investigated by electrocardiograms, 3D echocardiography, magnetic resonance imaging (MRI), invasive conductance catheter measurements, histology, flow cytometry and determination of plasma hsTnT. Systemic hemodynamics were assessed by conductance catheter measurements. Circulating catecholamines were determined by HPLC and immune-assays. Inflammatory markers were analyzed by flow cytometry.
Results:
Following tMCAO hsTnT levels were elevated 4-fold compared to sham-operated controls. tMCAO caused a systolic left ventricular dysfunction with significantly reduced stroke volume and impaired global longitudinal strain. Concomitantly reduced cardiac output, impaired ventricular pressure development, and lower mean arterial pressure were observed. Paradoxically, we observed a severe bradycardia. This was accompanied by a systemic inflammatory response characterized by granulocytosis, lymphopenia, increased levels of serum-amyloid A, and interleukin-6. Within myocardial tissue, we noted altered expansion of extracellular space as evidenced by MRI relaxometry, and in parallel number of granulocytes, apoptotic cells, and expression of pro-inflammatory cytokines were elevated.
Conclusion:
The brain-heart-axis frequently induces specific patterns of cardiac and circulatory adaption to AIS. Acute myocardial infarction does not contribute to this interaction. But an acute myocardial injury with systolic dysfunction and reduced cardiac output occurs, which is accompanied by altered myocardial tissue characteristics associated with a systemic and local myocardial inflammatory response.
Aktualisiert: 2019-12-31
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Influence of testosterone on proteinuria and nephropathy in the rat models of chronic renal disease
Albuminuria associated with chronic renal disease is the most important poly-genetic characteristic for the origin of cardiovascular as well as renal diseases. Many studies have revealed that androgens such as testosterone are of paramount importance for the progression of chronic renal disorders. For example, there is an enhanced de-cline of renal functions in male compared to female patients leading to an accelerat-ed formation of proteinuria as well as albuminuria. Due to their genetically determined mode animal models such as MWF as well as Dahl/SS-rats can be employed to show the correlation between albuminuria and their hormonal balance. The aim of this work was to verify whether it is possible to influence albuminuria in combination with different accompanying phenotypic characteristics such as blood pressure by castration. By this procedure testosterone should have been eliminated nearly com-pletely. The studies were performed in MWF and Dahl/SS-rats using Wistar rats as control group. Further the inhibition of all testosterone receptors in combination with castration and hormone replacement therapy was investigated. In preliminary studies to this work, three different aspects were covered. Firstly, physiological values of tes-tosterone in every rat strain were evaluated. Secondly, it could be shown that castra-tion of MWF as well as Dahl/SS-rats has independent from its timing a protective ef-fect towards the origin of an albuminuria. Already one week after castration a signifi-cant decline of an albuminuria could be detected even in rats with a progressed renal disorder. Thirdly, it was evaluated whether physiological values of testosterone could be achieved by its substitution to be able to perform the hormone replacement thera-py. On the basis of the preliminary studies a group design could be elaborated and used within this work. As a double controlled study a hormone substitution after cas-tration in parallel with the inhibition of testosterone receptors by flutamide - a selec-tive antagonist against androgens receptor - was performed. A clear and significant decline of an albuminuria could be shown within the castrated groups in both rat populations - namely MWF and Dahl/SS. Castration was performed at 10 weeks of age. The treatment with flutamide revealed that this decline was solely due to effect of testosterone. An effect on blood pressure in all examined study groups did not show a significant change concluding that testosterone does not have a detectable effect on blood pressure. Nevertheless, a direct correlation of presence and absence of testosterone and renal clearance of albumin could be impressively demonstrated within this work. After castration, the degree of albuminuria decreased about 50%. This effect could further be dramatically increased by additional inhibition of testos-terone receptors. In addition, different other phenotypic characteristics were evaluat-ed. The determination of a biomarker for renal function called cystatin C did not re-veal a significant difference between the different study populations. The histological-ly determined parameters showed a regression of renal impairment in castrated as well as testosterone and flutamide medicated study groups. Renal impairment mark-ers Kim1 and Ngal were determined molecular genetically. Results here also showed that values significantly decreased after castration and subsequent medication with testosterone as well as flutamide. The values obtained were comparable to values of the control Wistar group. Interestingly, Kim1 also showed decreasing values after pure castration. The obtained results of the performed study provide significant evi-dence that albuminuria in MWF as well as Dahl/SS-rats could be decreased after nearly complete elimination of testosterone production and inhibition of testosterone receptors. In addition, histological markers as well as molecular markers such as Ngal and Kim1 support these findings by testifying a decline in renal impairment. The results of this set the stage for potential translations of these findings into individual and standardized therapeutic strategies for treatment or prevention of renal diseases in humans.
Aktualisiert: 2019-12-31
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Model for the implantation of implants stimulating the body’s own mechanisms for repair and regeneration of ovine annulus fibrosus defects.
The surgical management of herniated discs often involves removal of the prolapsed tissue and subsequent replacement of the nucleus pulposus. Invasive surgical access via the annulus fibrosus frequently leads to further tissue defects and consequently to additional damage to the existing damage of the annulus fibrosus. Numerous experimental studies on the treatment of degenerative and traumatic changes in intervertebral discs report results of surgical treatment with the aim of repair and regeneration of the nucleus pulposus. The success of these therapeutic methods largely depends on the functional restoration of the annulus fibrosus, since only an intact annulus fibrosus can resist the pressure from inside the intervertebral disc and thus prevent recurrent herniation. Therapeutic methods taking advantage of the regenerative potential of the annulus fibrosus are referred to as Annulus Fibrosus Tissue Engineering. They are based on the implantation of various different scaffolds and cells fostering repair and regeneration.
The aim of this study was to assess the suitability of the model under review to test the suitability of the absorbable implants used for the treatment of annulus fibrosus defects. In the present study, for the first time, an implant in combination with a human recombinant chemokine TECK (CCL25) and in combination with PRP was tested for its bio-compatibility and stability in an in vivo test for annulus fibrosus defect healing in a sheep model. Since the chemokine TECK is a human recombinant chemokine, the effect of this specific chemokine on ovine annulus fibrosus cells was studied in vitro in a chemotaxis assay and also in a 3D cell culture before testing in vivo. In vitro, the human recombinant chemokine TECK was able to dose-dependently induce migration of ovine annulus fibrosus cells, which was significant at concentrations of 750nM and 1000nM. Hence, the receptor ligand of the human recombinant chemokine TECK not only binds to human cells, but also to the chemokine receptor of ovine annulus fibrosus cells. In addition, in 3D cell culture, the ovine annulus fibrosus cells were able to generate proteoglycans in the presence of human recombinant chemokine TECK. In combination with PRP, the ovine annulus fibrosus cells generated almost no proteoglycans. For the first time, the suitability of the human recombinant chemokine TECK for use in animal experiments on sheep could be demonstrated with these in vitro experiments.
In the following animal experiment, 3.5mm x 3.5mm defects were set via a retroperitoneal approach to the annulus fibrosus of the lumbar intervertebral discs of 30 experimental ovine animals. The experimental animals were randomized into 5 groups of 6 (groups A to E). Group A (empty defect), where a defect was set in the annulus fibrosus and subsequently not covered with an implant, was the control group to study the body's own repair and regeneration mechanisms. In groups B to E, the defect was covered with various combinations of implants and therapeutic substances. A macroscopic and histological evaluation was carried out 3 months after surgery.
The assessed model is suitable for testing absorbable implants as this thesis shows, that:
• the sheep was an acceptable model for the study of new surgical therapies with implants for the repair and regeneration of annulus fibrosus defects, since the proportional anatomical conditions are comparable with humans and the same surgical techniques (instruments and implants) were used as would be under clinical conditions for humans. In summary, the model and surgical techniques are transferable to humans. The assessed model is suitable to demonstrate this.
• the retroperitoneal access as well as the defect setting with scalpel and tweezers was reproducible in all animals with increasing efficiency.
• the attachment method with sutures at the four corners of the implant reliably prevented dislocation of the absorbable implants.
• the explantation, anatomical preparation, and preparation of specimens were reproducible.
• histological hematoxylin / eosin staining proved to be a reliable diagnostic tool to study implant bio-degeneration, recurrent herniation rates, and, thus, defect stabilization.
For future use of the assessed model in new studies however, the implant attachment method should be modified to allow for clinically safe, reproducible application and easy integration of the method into existing surgical protocols. A surgical application aid should be used for the challenging application of sutures, since in each instance several attempts to correctly place the implant were required. Also, hematoxylin / eosin staining as used in the assessed model did not allow conclusions as to the quality of the regenerated tissue, and, thus, not as to the effectiveness of the applied therapeutic substances on tissue repair and regeneration. Only quantitative effects could be assessed. The hypothesis, whether human recombinant chemokine TECK (CCL25), in addition to the demonstrated in vitro effect, also has an in vivo effect on defect healing of ovine annulus fibrosus cells, could not be assessed with the methods under review. Hence, for future use of the model, defects of equal size should be set in all animals, and the study of the defect content should also be in the focus of further research. Since the model is suitable in principle, with defects set of equal size, a classification system for quantitative analysis of tissue repair and regeneration between groups of animals as well as relative to the chemokine TECK used can be developed.
Aktualisiert: 2019-12-31
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Histological analysis of the bone and cartilage healing process of a metallic implant in an osteochondral defect
The aim of this study was to investigate cartilage and bone healing potential of a palliative osteoarthrosis implant with Hydroxyapatite-coatings in a locally defined osteochondral defect. The hypothesis was that chondrointegration of the implant can be improved by a HA coating and enhance the overall-healing outcome. A standardized osteochondral defect was induced in 24 female Merinomix shep on the medial femoral condyle of the right knee joint and three different metallic implant types were inserted in 8 animals/each: an uncoated implant, implants with 2 HA-coatings (rough, smooth). After 3 months, the animals were sacrificed and the tissueimplant contact was analyzed histological, histomorphometrical and immunohistochemical. Histological evaluation of the cartilage and bone tissue was carried out after embedding in PMMA (with implant) or Paraffin (without implant) and stainging with giemsa or toluidinblue. Histomorphometrical analysis measured the occurrence of tissue types at the implant border. The results of the study showed a significant better contact to the adjacent bony/chondral tissue in the groups with coated implants compared to the group of the uncoated implants. This was proven histomorphometrically by a lesser gap formation and less space between the implants and the surrounding tissue. As hypothesized, the coated implants showed a better chondrointegration in the mineralized cartilage and subsequently lesser gap formation. This resulted in an improved attachment of hyaline cartilage and prevented the underlying bone from contact with the aggressive synovial fluid. Through the firm contact of the tissue surfaces with the coating, a gap formation and subsequent loosening of the implant is prevented. Sealing against the aggressive synovial fluid is possible after a 3-months healing period.
The sealing effect of the attached mineralized cartilage and the subsequent preservation of the bone stock is a promising finding, even though we were not able to clarify the mechanism behind it in the context of this study. In the long run the better contact should result in better subchondral bone quality, which again affects the quality of the overlying cartilage positively. Future studies with longer healing times could emphasize the differences. Thus, HA-coated implants for focal osteoarthritis represent an alternative to relieve pain and prevent further damage in osteoarthritic joints.
Aktualisiert: 2019-12-31
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