G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind.
Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich.
Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden.
Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde.
Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.
Aktualisiert: 2023-06-26
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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind.
Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich.
Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden.
Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde.
Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.
Aktualisiert: 2023-06-26
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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind.
Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich.
Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden.
Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde.
Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.
Aktualisiert: 2023-06-26
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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind die größte Rezeptorfamilie des Menschen und an der Steuerung wichtiger physiologischer Funktionen beteiligt. Daher greift eine Vielzahl von Medikamenten an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an. Nanopartikel (NPs), die aktuell ein großes Interesse in der biomedizinischen Forschung erfahren, können mit Liganden dieser Rezeptoren funktionalisiert werden. Die funktionalisierten Nanopartikel können im Vergleich zur „klassischen“ Applikationsform von pharmakologisch wirksamen Einzelmolekülen zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem besseren Transport von Wirkstoffen über biologische Barrieren und möglicherweise einer Reduktion der Nebenwirkungen führen. In meinem Projekt wurde neben Carbachol-, Adrenalin- bzw. Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln auch die Wirkung von Goldnanopartikeln, welche mit dem muskarinergen Rezeptorantagonisten Atropin funktionalisiert waren, untersucht. Ziel meiner Arbeit war dabei, herauszufinden, ob die biofunktionalisierten Goldnanopartikel an typischen Zielgeweben mit adrenergen oder cholinergen Rezeptoren wirksam sind.
Die adrenerg funktionalisierten NPs waren in der Lage, am Kolonepithel, das mehrere Subtypen von β-Rezeptoren exprimiert, eine K+-Sekretion auszulösen. Experimente an isolierten Kardiomyozyten ergaben, dass sie in der Lage sind, β1-Rezeptoren zu stimulieren, wodurch sie an den Herzmuskelzellen die Inotropie steigern (hemmbar durch den β1-Rezeptorblocker Atenolol). Glattmuskuläre β2-Rezeptoren, die therapeutisch bei der Behandlung des Asthma bronchiale einen zentralen Angriffspunkt darstellen, werden von Adrenalin- oder Noradrenalin-funktionalisierten Goldnanopartikeln allerdings nicht stimuliert, wie Organbad-Versuche zur Messung der isometrischen Kraftentwicklung von isolierten Tracheal- und Bronchialringen zeigten. Eine Bronchodilatation durch Atropin-funktionalisierte NPs war hingegen durch subnanomolare Konzentrationen dieser Partikel möglich.
Um die Passagefähigkeit durch das Darmepithel, die eine entscheidende Voraussetzung für eine orale Bioverfügbarkeit der NPs wäre, zu untersuchen, wurden zwei Ansätze gewählt. Dabei wurde bestimmt, ob Atropin-NPs nach mukosaler Applikation Muskarinrezeptoren auf der basolateralen Membran von Epithelzellen bzw. auf der glatten Muskulatur der Tunica muscularis hemmen können. In der Tat verminderten mit Atropin funktionalisierte NPs zeitabhängig sowohl die durch das stabile Acetylcholinderivat Carbachol ausgelöste Cl--Sekretion als auch Kontraktionen, die durch Stimulation cholinerger Neurone des enterischen Nervensystems (ausgelöst durch elektrische Feldstimulation) induziert wurden. Die systematische Variation des Goldkerndurchmessers im Bereich von 8 bis 16 nm in 1 bis 2 nm großen Schritten ergab eine glockenförmige Abhängigkeit der Hemmwirkung von Atropin-NPs an Muskarinrezeptoren mit einem Optimum zwischen 12 und 14 nm. Der Nachweis von Goldnanopartikeln in transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Inkubation von Zellen mit den Nanopartikeln spricht dafür, dass die funktionalisierten Nanopartikel wahrscheinlich per Endozytose in Zellen aufgenommen werden.
Eine massive Potenzierung im Sinne einer Steigerung der Affinität wurde – wie schon aus vorherigen Publikationen meiner Arbeitsgruppe aus Experimenten am Darmepithel bekannt – für Nanopartikel beobachtet, die mit Carbachol funktionalisiert worden waren. Sie induzierten in meinen Experimenten schon in pikomolaren Konzentrationen einen Anstieg der isometrisch gemessenen Muskelkraft intestinaler Längsmuskelpräparate und führten an isolierten Kolonkrypten zu einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration, der zeitlich gesehen deutlich stabiler ausfiel als derjenige, der durch natives Carbachol ausgelöst wurde.
Die Ergebnisse meines Projekts zeigen, dass cholinerg und adrenerg funktionalisierte Goldnanopartikel an den adressierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (wenn auch nicht an allen, wie im Fall von β2-Rezeptoren) abhängig von ihrem Durchmesser wirksam sind. Sie sind außerdem in der Lage, zeitabhängig das Darmepithel zu passieren. Damit erfüllen sie prinzipielle Voraussetzungen für die weitere Prüfung ihrer Anwendungsmöglichkeit z.B. zur Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinal- oder des Respirationstrakts.
Aktualisiert: 2023-06-26
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Nanopartikel sind kleine Partikel mit einem Durchmesser von 1 bis 100nm (Soliman et al., 2015, Hühn et al., 2017). Für die Zellmarkierung spielen sie eine interessante und zukunftsrelevante Rolle, insbesondere in der fortschreitenden Entwicklung der Anwendung von Stammzellen in der regenerativen Stammzelltherapie (Kustermann et al., 2008, Arnhold & Wenisch, 2015, Kolecka et al., 2017). Die Darstellung der Nanopartikel, bzw. später der markierten Zellen, soll im Rahmen dieser Studie mit der Magnetresonanztomographie (MRT) als ein nicht invasives bildgebendes Verfahren untersucht werden (López-Lagunaa et al., 2011, Schmied, 2018). In der vorliegenden Studie werden 4nm große superparamagnetische Eisenoxid Nanopartikel (SPIO) und 100nm große goldhaltige Nanopartikel (AuNP) als MRT- Kontrastmittel in verschiedenen Konzentrationen an sieben unterschiedliche speziell zur Darstellung der Nanopartikel entwickelten MRT- Untersuchungssequenzen überprüft. Dies wird anhand eines Kadavermodels nach intramuskulärer ultraschall-gestützter Injektion der Nanopartikel am lateralen Kopf des M. gastrocnemius in Anlehnung an Muskulotendinopathien des M. gastrocnemius bei athletischen Hunderassen durchgeführt (Kaiser et al., 2016). Die hier verwendeten Konzentrationen sind um ein Vielfaches geringer als diejenigen von Vergleichsstudien zur Darstellung und Überprüfung von zellmorphologischen und funktionalen Effekten (Wen et al., 2013, Kolecka et al., 2017, Schmied, 2018).
Die Eisenoxidnanopartikel können mit dem MRT besonders kontrastreich dargestellt werden. Dabei fällt die gemessene Signalintensität mit steigender Konzentration an SPIO konzentrationsabhängig ab. Dies wird insbesondere bei Gradientechosequenzen (GRE) deutlich, da diese zur Darstellung der von SPIO verursachten Suszeptibilitätsartefakte am geeignetsten sind (Westbrook et al., 2011). Die hohe Korrelation zwischen objektiver und subjektiver Messung erlaubt eine adäquate subjektive Einschätzung seitens des Untersuchers. Für die klinische Anwendung werden folgende Sequenzen zur Darstellung der SPIO empfohlen: T1 gewichtete (w) Turbo-Spin-Echo (TSE) (ab 146,48nM) als anatomische Übersichtsaufnahme, die T2w TSE (ab 146,48nM, besser ab 219,72nM) zur Darstellung akuter pathologischer Läsionen, die T2w GRE (sagittal und transversal, ab 146,48nM) zur optimalen Darstellung der SPIO und die Short Tau Inversion Recovery (STIR) Sequenz zur Unterscheidung von akuter und chronischer Läsionen (ab 494,36nM, besser ab 741,55nM). Die protonengewichteten Aufnahmen sind für klinischen Bereich nicht relevant.
Im Gegensatz zu den Eisenoxidnanopartikeln ist der Kontrast der diamagnetischen Goldnanopartikel deutlich schwächer ausgeprägt. So zeigen die Partikel in diesem Versuchsaufbau lediglich bei der T2w GRE Sequenz einen deutlich hypointensen erkennbaren konzentrationsabhängigen Verlauf (ab 0,00336nM). Dennoch wäre es möglich, die vielseitigen anderen Eigenschaften (z.B. Oberflächenplasmonresonanz, Biosensor, CT etc.) der Goldnanopartikel zu nutzen um multimodale Kontrastmittel herzustellen, indem sie mit anderen MRT-Kontrastmittel, wie z.B. Gadolinium-Chelate, verknüpft werden (Huang et al., 2007, Alric et al., 2008, Park et al., 2010, Colombo et al., 2012).
In möglichen auf diese Arbeit aufbauenden Studien könnte untersucht werden, ob die mit SPIO markierten mesenchymalen Stammzellen in den oben genannten niedrigen Konzentrationen mittels MRT im Kadavermodell darstellbar sind. Anschließend könnte in einer weiteren in vivo Studie mittels ultraschall-gestützter Injektion die Lokalisation und der zeitliche Verbleib der markierten Stammzellen im Organismus überprüft werden. In diesem Versuchsaufbau wären auch biologische und potentiell toxikologische Fragestellungen im Organismus aufschlussreich. Schlussendlich ist es im Rahmen der regenerativen Stammzelltherapie das Ziel Patienten mit markierten Stammzellen unterstützend zu therapieren.
Das Fazit aus dieser Dissertation lautet, dass SPIO in den oben genannten Untersuchungssequenzen und Konzentrationen ausreichend Signal erzeugen, um optimal mittels MRT objektiv und subjektiv dargestellt werden zu können. Dabei begünstigt die äußerst niedrige Konzentration im Rahmen der Zellmarkierung die Zellvitalität, sodass später der gewünschte therapeutische Effekt der regenerativen Stammzelltherapie bestmöglich ausgenutzt werden kann.
Schlüsselwörter: Eisenoxidnanopartikel, Goldnanopartikel, Entwicklung von MRT-
Untersuchungssequenzen, Stammzelltherapie, Zellmarkierung, Kadavermodel, Muskulotendinopathie vom M. gastrocnemius
Aktualisiert: 2021-12-22
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Bereits seit vielen Jahren werden metalloide Goldcluster synthetisiert und charakterisiert. Dadurch erhofft man sich einen tieferen Einblick in die Eigesnchaften solcher Clusterverbindungen und den Bildungsmechanismus von Gold in der Festkörperphase und zu erhalten. In dieser Arbeit werden eine vielzahl bekannter und unbekannter Gold(I)-Verbindungen mit schwefelhaltigen Substituenten und Phosphanliganden synthetisiert. Diese werden anschließend über eine modifizierte Brust-Schiffrin-Methode oder in einem Einphasensystem reduziert. Auf diesem Weg lassen sich einige neue Goldcluster und metalloide Goldcluster synthetisieren und strukturell charakterisieren. Diese zeigen bereits bekannte Motive in der Goldclusterchemie aber auch neue, bisher unbekannte Strukturen, wodurch sie zu einem besseren Verständnis beitragen und das bereits vorhandene Wissen erweitern können.
Aktualisiert: 2022-03-17
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Judith Krawinkel zeigt anhand von Goldnanostrukturen, dass deren Interaktion mit Laserstrahlung das Potenzial hat, schonend und effizient Wirkstoffe in Zellen einzubringen, diese gezielt zu eliminieren oder genetisch zu manipulieren. So eignen sich membranadhärente sphärische Goldnanopartikel zum Einbringen von Molekülen in Zellen. Vor allem bei Primärzellen empfiehlt die Autorin die Zugabe von Radikalfängern. Zudem nutzt sie peptidkonjugierte Goldnanopartikelagglomerate, die die Aufnahme extrazellulärer Moleküle über Endozytose unterstützen. Laserbestrahlung bewirkt effizientes intrazelluläres Freisetzen der Moleküle und der Agglomerate, die dabei in biokompatiblere Produkte zerteilt werden. Durch Bestrahlen goldbeschichteter Oberflächen mit Lasern entstehen Nanopartikel und Kavitationsblasen, die eukaryotische Zellen irreversibel schädigen und Biofilme manipulieren können.
Aktualisiert: 2023-04-01
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Judith Krawinkel zeigt anhand von Goldnanostrukturen, dass deren Interaktion mit Laserstrahlung das Potenzial hat, schonend und effizient Wirkstoffe in Zellen einzubringen, diese gezielt zu eliminieren oder genetisch zu manipulieren. So eignen sich membranadhärente sphärische Goldnanopartikel zum Einbringen von Molekülen in Zellen. Vor allem bei Primärzellen empfiehlt die Autorin die Zugabe von Radikalfängern. Zudem nutzt sie peptidkonjugierte Goldnanopartikelagglomerate, die die Aufnahme extrazellulärer Moleküle über Endozytose unterstützen. Laserbestrahlung bewirkt effizientes intrazelluläres Freisetzen der Moleküle und der Agglomerate, die dabei in biokompatiblere Produkte zerteilt werden. Durch Bestrahlen goldbeschichteter Oberflächen mit Lasern entstehen Nanopartikel und Kavitationsblasen, die eukaryotische Zellen irreversibel schädigen und Biofilme manipulieren können.
Aktualisiert: 2023-04-04
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Ein wichtiger Bereich der Molekularmedizin ist die genetische Veränderung von Zellen
durch Transfektion. Hier bieten Primär- und Stammzellen großes Potential, um
gentherapeutische Ansätze zu entwickeln. Ferner kann das Einschleusen von Nukleinsäuren
wie siRNA im Hochdurchsatz zur Identifizierung der Funktion von Zielgenen
und damit zur Wirkstofffindung dienen. Etablierte Methoden, wie Elektroporation oder
virale Transduktion, sind für diese Transfektionsanwendungen nicht immer geeignet.
Hier bietet die fs-Optoinjektion die bisher beste Alternative der laserbasierten Verfahren.
Jedoch handelt es sich um eine Einzelzelltransfektion mit geringem Durchsatz.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer plasmonenbasierten Transfektionsmethode
im Hochdurchsatz mit hoher Effizienz bei geringer Toxizität. Ebenfalls sollte
die Methode selektiv und zelltypunabhängig sein. Um Nukleinsäuren in Zellen einzuschleusen,
muss die Zellmembran für diese permeabilisiert werden. Die Interaktion
von ultrakurzen Laserpulsen mit membranlokalisierten Goldnanopartikeln führt zur
lokalen, transienten Membranperforation. Durch das Abrastern der Zellen mit einem
schwach fokussierten Laserstrahl wird so ein hoher Durchsatz erreicht.
Mit einem fs-Laser wurden die optimalen Parameter für eine transiente Permeabilisierung
der Zellmembran evaluiert und für die Transfektion von Zelllinien sowie Primär-
und Stammzellen angewendet. Diese Parameter zeigten keine negativen Auswirkungen
auf die Nanopartikel, die Zellvitalität oder auf die einzubringenden Moleküle.
Die Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen lag bei unter
1 %. Kleinere Moleküle wie siRNA konnten mit einer Effizienz von mehr als 90 % bei
einer Zellvitalität von 93 % in die Zellen eingebracht werden. Durch eine siRNATransfektion
kam es in Tumorzellen zur Suppression des Onkogens HMGA2 um
50 %. Auch mit einem ps-Laser konnte eine effiziente Gensuppression in drei Zelllinien
mit verschiedenen siRNA bei geringer Konzentration (0,3 nM) erreicht werden.
Die Transfektion von primären Neuronen mit fluoreszenzmarkierter siRNA erfolgt mit
einer Effizienz von 70 %. Eine selektive Zellmanipulation wurde durch die gezielte
Bestrahlung oder durch Markierung der Zellen mit Nanopartikeln gezeigt. Ebenfalls
wurden zwei weitere Transfektionskonzepte für den Hochdurchsatz, mittels struktureller
Oberflächen und Glaskugeln, getestet. Grundlegende Untersuchungen deuten
auf Nahfeldeffekte als initialen Mechanismus der Membranpermeabilisierung hin. Es
wurden eine Öffnungszeit der Membran von 61 ms und eine minimale Porengröße
von 28 nm abgeschätzt, durch die Moleküle bis 2000 kDa ins Zytoplasma diffundierten.
Dabei hat die Ladung der Moleküle vermutlich einen Einfluss auf die Effizienz.
Mit der Entwicklung eines Funktionsmusters ist es gelungen, die plasmonenbasierte
Transfektion von kleinen Molekülen im Hochdurchsatz für Anwendungen in der Klinik
oder im Genlabor als Alternative einzusetzen. Die erzielten Ergebnisse stellen einen
erheblichen Fortschritt bei der Etablierung von laserbasierten Methoden dar und
eröffnen somit neue Wege in der Grundlagenforschung, der Molekularmedizin sowie
für die in vivo Anwendung.
Aktualisiert: 2019-10-17
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